清熱祛濕外洗方制備工藝及薄層鑒別*

丁美林，張香玉，江建國

（1.東臺市中醫院，江蘇 東臺 224200；2.上海中醫藥大學，上海 200120；3.如東縣中醫院，江蘇 如東 226400）

清熱祛濕外洗方是江蘇省如東縣中醫院協定方，由連翹、黃柏、苦參、板藍根等中藥組成，具有清熱解毒、化濕透邪的功效，臨床用于治療兒童發熱、手足口皰疹，伴有潰瘍疼痛、納差等癥狀，也就是兒童常見的手足口病。經多年臨床應用并驗證，清熱祛濕外洗方對兒童患者使用方便、療效良好。現代藥理研究表明，金銀花中有機酸有抗炎、抗病毒、抗菌等藥理活性[1]；苦參中苦參酮、異黃腐醇、槐屬二氫黃酮G 和苦參醇I 具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[2]；板藍根木脂素類成分對流感病毒誘導炎癥反應具有免疫調節作用[3]；黃柏主要含有生物堿類、酚酸類、三萜類和黃酮類等成分，具有抗炎、抗菌、降血壓和免疫抑制等藥理活性[4]。選用君藥黃柏中鹽酸小檗堿的含量、清熱祛濕外洗方干膏率綜合評分作為指標，正交試驗確定清熱祛濕外洗方的制備工藝，本研究根據《中國藥典》（2020 年版）四部項下，薄層色譜鑒別法對連翹、苦參、黃柏、板藍根進行薄層色譜鑒別，以期為醫院制劑的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PHS-25B PH 計（上海大普儀器有限公司）；HPB-425i BEL 十萬分之一電子天平（意大利貝爾Engineering srL）；HN101-1A 恒溫電熱干燥箱（上海蘇進儀器設備廠）；WFH-203B 三用紫外分析儀（上海馳唐實業有限公司）；QCD3120 超聲波清洗器（天津旗美科技有限公司）；HH-S2 數顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；DW-2 型調溫電熱器（南通市長江光學儀器有限公司）。

1.2 試藥

苦參堿對照品（批號：110805-201709）；鹽酸小檗堿（批號：110713-202015，中國食品藥品檢定研究院）；槐定堿對照品（批號：110784-201706，中國食品藥品檢定研究院）、連翹對照藥材（批號：120908-201817，中國食品藥品檢定研究院）；板藍根對照藥材（批號：121177-201608，中國食品藥品檢定研究院）；硅膠G 板（批號：20220507；青島海洋化工有限公司）、硅膠G 板（批號：20220508；青島勝海精細硅膠化工有限公司）、硅膠G 板（批號：20140701；煙臺芝罘黃務硅膠開發試驗廠）；清熱祛濕外洗方（批號：20220218）；所用中藥飲片均購自南通市三越飲片有限公司。

2 方法與結果

2.1 清熱祛濕外洗方的制備工藝

2.1.1 浸泡時間與吸水率的考察

稱取處方量藥材，置于燒杯中，加入一定量的水，在室溫下靜置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，每個時間段倒出被藥材吸收剩下的藥液體積，量取體積，稱取重量，計算吸水率[5]，由浸泡清熱祛濕方的時間與吸水率考察結果得出，清熱祛濕外洗方浸泡3 h 左右即可，吸水率為197%。

2.1.2 正交試驗

采用正交試驗對水提取工藝進行考察，影響水提的主要因素為A 加水量（倍）、B 煎煮時間（h）、C 煎煮次數（次），將清熱祛濕外洗方中鹽酸小檗堿的含量、干膏率的綜合評分作為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計優選最佳提取工藝參數[6]。因素與水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。分析表明，在清熱祛濕外洗方水提過程中，加水量與煎煮次數為顯著性影響因素（P＜0.05），可根據生產實際情況調整。正交試驗優選的最佳工藝為A3B3C2，即加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 小時。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

表3 方差分析結果

2.2 清熱祛濕外洗方的薄層色譜鑒別

2.2.1 連翹鑒別

取本品溶液20 ml，離心，去除上清液，取沉淀物，加乙醚5 ml 萃取3 次，合并濾液，水浴揮干，殘渣加甲醇1 ml 使其溶解，作清熱祛濕外洗方供試品溶液，同法制備（缺連翹）陰性對照溶液。取連翹對照藥材6 g，加水回流提取，取連翹對照藥材溶液20 ml，加乙醚萃取3 次，每次5 ml，過濾，合并濾液，揮干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為連翹對照藥材溶液。吸取10 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、連翹對照藥材溶液、陰性對照溶液，按照2020 年版《中國藥典》通則0502 試驗，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶10∶0.25）為展開劑，展開后噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外燈光（365 nm）下檢視斑點，陰性對照無干擾，結果見圖1、圖2。

圖1 連翹薄層色譜鑒別圖（預實驗）

圖2 連翹薄層色譜鑒別圖

2.2.2 苦參鑒別

取清熱祛濕外洗方10 ml，用氨試液調置pH 9～10，加三氯甲烷5 ml 萃取3 次，合并濾液，水浴揮干，殘渣用1 ml 無水乙醇溶解，作清熱祛濕外洗方供試品溶液，同法制備（缺苦參）陰性對照溶液。取苦參堿、槐定堿、苦參堿和槐定堿對照品，分別加一定量乙醇制備成對照品溶液。吸取2 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、苦參堿對照品溶液、槐定堿對照品溶液、混合對照品溶液、陰性對照溶液，按照2020 年版《中國藥典》通則0502 試驗，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5）為展開劑，展開，噴以碘化鉍鉀溶液，出現顯著斑點，陰性對照無干擾，結果見圖3、圖4。

圖3 苦參薄層色譜鑒別圖（預實驗）

圖4 苦參薄層色譜鑒別圖

2.2.3 黃柏鑒別

取清熱祛濕外洗方10 ml，水浴蒸干，加甲醇10 ml，超聲處理15 min，過濾，取濾液作供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml 含0.1 mg 的溶液，作對照品溶液，同法制備（缺黃柏）陰性對照溶液。取黃柏對照藥材0.2 g，加甲醇10 ml，超聲20 min，作黃柏對照藥材溶液。吸取1～3 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液、陰性對照溶液，按照2020年版《中國藥典》通則0502 試驗，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，置紫外燈光（365 nm）下檢視，出現顯著斑點，陰性對照無干擾，結果見圖5、圖6。

圖5 黃柏薄層色譜鑒別圖（預實驗）

圖6 黃柏薄層色譜鑒別圖

2.2.4 板藍根的薄層鑒別

取清熱祛濕外洗方20 ml，超聲30 min 后離心，保留上清液，水浴蒸干，加甲醇1 ml 使其溶解，作供試品溶液，同法制備（缺板藍根）陰性對照溶液。取板藍根對照藥材2 g，加80%甲醇20 ml，超聲30 min，靜置一夜，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使其溶解，作板藍根對照藥材溶液。吸取10 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、板藍根對照藥材溶液、陰性對照溶液，按照2020年版《中國藥典》通則0502 試驗，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-石油醚（1∶1）為展開劑，展開，置紫外燈光（254 nm）下檢視，出現顯著斑點，陰性對照無干擾，結果見圖7、圖8。

圖7 板藍根薄層色譜鑒別圖（預實驗）

圖8 板藍根薄層色譜鑒別圖

3 討論

3.1 對清熱祛濕外洗方的制備工藝討論

清熱祛濕外洗方治療小兒手足口病，可加速皰疹消退，作為如東縣中醫院院內協定方已使用多年，兒科醫師通過臨床觀測考察，清熱祛濕外洗方臨床療效顯著，且安全可靠，表明清熱祛濕外洗方有其研究的價值。處方中連翹、苦參、黃柏、板藍根等，具有清熱解毒、化濕透邪的功效，可抑制炎癥及調節免疫功能，是治療小兒手足口病的重要機制[7]，且外洗方式便于兒童患者接受[8]，因此綜合分析確定清熱祛濕外洗方為水提工藝，外洗方式。根據中藥君臣佐使處方分析，將君藥黃柏中的鹽酸小檗堿、處方藥的干膏率做為考察指標，用正交試驗確定制備工藝，為開發清熱祛濕外洗方制備工藝打下良好的基礎。

3.2 對清熱祛濕外洗方的薄層色譜鑒別討論

連翹薄層色譜鑒別過程中參照文獻[9]，不能達到預期結果，而連翹在清熱祛濕外洗方中屬于君藥之一，考慮連翹在處方分析中重要性，所以重新制定符合清熱祛濕外洗方中連翹鑒別方案。總結分析在相同的條件下，對照藥材溶液能出現顯著的斑點而供試品溶液不能出現顯著結果，所以需重新考察清熱祛濕外洗方供試品溶液的制備。清熱祛濕外洗方溶液為酸性溶液，連翹中含有醇苷，在酸性條件下不穩定，而選擇加熱水解能很好的分離出有效成分[10]，因此選擇加熱水解制備連翹對照藥材溶液，其他條件不變的情況下，能達到對連翹的薄層色譜鑒別。

苦參薄層色譜鑒別過程中，曾參照《中國藥典》[11]苦參項下鑒別，不能出現顯著性斑點。根據苦參的化學性質[12]，總結分析實驗需要調整展開劑的比例，因此將展開劑比例調整為甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5），其他條件未變，能出現顯著斑點但斑點有重疊現象。根據斑點重疊現象，分析提示可能是由于甲苯、丙酮等分析試劑為揮發性溶液，不利于斑點的分離，最終在其他條件不變的基礎上將鑒別環境選擇低溫干燥下進行，斑點易分開，能夠達到預期結果。

黃柏薄層色譜鑒別研究的文獻較多，文獻報道黃柏在不同的展開劑均能很好地出現顯著性斑點，為了準確地找出清熱祛濕外洗方中黃柏薄層色譜鑒別方案，因此將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品溶液制備方式、鑒別環境等相同條件下，展開劑選取正丁醇-冰醋酸-水[13]、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水[14]、二氯甲烷-甲醇-濃氨[15]分別進行考察，均能不同程度顯現斑點，根據實際操作情況，最終確定方便易得的正丁醇-冰醋酸-水，定為清熱祛濕外洗方黃柏薄層鑒別的展開劑。

板藍根在中藥君臣佐使分析中屬于佐使藥，顧全處方全局選取板藍根進行薄層色譜鑒別，在初期方案中選取（R，S）-告依春、氨基酸、靛玉紅等為對照品溶液，相同的環境下進行預實驗考察，結果對照品溶液均不太理想[16]。因此，選用板藍根對照藥材作為對照溶液進行預實驗，對照藥材與供試品溶液預實驗初期結果較為理想，薄層色譜鑒別過程中為了能夠有效地達到預期結果，采用預實驗與正式試驗，驗證試驗的可重復性，因此根據預實驗方案選定為板藍根的最終實驗方案。

3.3 總結

綜上所述，將清熱祛濕外洗方處方藥浸泡3 h，加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h，結果表明清熱祛濕外洗方提取工藝穩定可行。該制劑中連翹、苦參、黃柏、板藍根的定性鑒別方法簡便、重現性好，為清熱祛濕外洗方的質量標準提供了參考。