血清TGF-β、IL-6與潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群的相關(guān)性

金洋，韋周兵，左逢勝

（ 1.信陽市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 信陽 464000；2.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 信陽 464000 ）

目前，潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）的病因和發(fā)病機制尚未完全明確，但與環(huán)境、腸道功能屏障障礙、免疫功能異常等密切相關(guān)［1］。且越來越多的研究證實，腸道菌群的失調(diào)與UC的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸道黏膜屏障的完整性及功能受到損害，且致病菌增殖及其分泌的腸毒素可導(dǎo)致腸道微環(huán)境改變，進一步增加腸道通透性，促使大量細菌及產(chǎn)物進入機體，影響腸道免疫功能，進而發(fā)病。另有研究證實，腸道內(nèi)菌群失衡可能是UC發(fā)生發(fā)展的始動因素［4］。因而，UC患者的腸道菌群情況得到了臨床醫(yī)生的重視。另外，免疫調(diào)節(jié)異常也是UC發(fā)病的重要機制，而在UC免疫異常中，細胞因子發(fā)揮著重要作用，相關(guān)的抗炎及促炎因子的平衡失調(diào)可導(dǎo)致免疫功能異常［5］。生長轉(zhuǎn)化因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）是具有多種生物活性的多肽，參與B細胞活化和體液免疫反應(yīng)；白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）是一種重要促炎因子，可增加巨噬細胞所產(chǎn)生的炎性細胞因子，促使中性粒細胞浸潤與腸道病變部位，引起腸道免疫功能異常。另有研究指出，腸道內(nèi)菌群紊亂是造成炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答改變的重要因素［6］。但是血清TGF-β、IL-6水平與腸道內(nèi)菌關(guān)系的臨床報道較少。鑒于此，本研究通觀察血清TGF-β、IL-6及腸道菌群在UC患者中的表達，進一步分析血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸道菌群的關(guān)系，以此為UC的臨床診療提供更多的參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2020年4月至2021年4月于信陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科就診的102例UC患者作為本次研究對象。102例UC患者中男49例，女53例，年齡28～55歲，平均（40.86±4.71）歲；病程8～31個月，平均（20.58±4.12）個月；發(fā)病部位：直腸39例，乙狀結(jié)腸27例，降結(jié)腸36例。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，且研究對象均簽署知情同意書。

納入標準：①UC符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年，北京）》［7］中相關(guān)標準，即患者多伴有腹瀉伴粘液膿血便、腹痛、腹脹等癥狀，且經(jīng)結(jié)腸鏡、糞便等檢查確診；②疾病處于活動期（改良Mayo評分［8］>2分）；③病程>4周；④神志清晰，均可配合本次研究。排除標準：①近期接受激素、益生菌、免疫抑制劑等藥物治療；②伴有細菌型痢疾、腸結(jié)核等感染性結(jié)腸炎；③腸道出血、腸穿孔；④伴有其他自身免疫性疾病；⑤處于妊娠期或哺乳期。

1.2 方法

1.2.1 病情程度評估方法 患者就診時均接受體格、血常規(guī)及相關(guān)實驗室指標檢查，參照改良Truelove和Witts疾病嚴重程度分型標準［9］評估患者病情評估患者的病情嚴重程度。劃分標準：①輕度：大便次數(shù)<4次/d；便血輕或無；脈搏≤90次/min；體溫<37.5℃；血紅蛋白正常（正常值：男性120～160 g/L，女性110～150 g/L）；紅細胞沉降率<20 mm/h。②重度：排便≥6次/d；便血較重；脈搏>90次/min；體溫>37.8℃；血紅蛋白<75%正常值；紅細胞沉降率>30 mm/h。③中度介于輕、重度之間。其中紅細胞沉降率、血紅蛋白檢測方法：取患者就診時空腹靜脈血6 mL，均分成2份（每份3 mL），其中1份樣本注入含有EDTA-2K的抗凝管中，充分混勻，以3 500 r/min速度離心10 min，取血漿，采用全自動血細胞分析儀（深圳市普康，PE-7200型）及配套試劑盒檢測血紅蛋白水平；采用紅細胞沉降率測定儀（北京普朗，PUC-2068B型）檢測紅細胞沉降率。

1.2.2 血清TGF-β、IL-6水平檢測方法 取另一份血液樣本，不進行抗凝處理，以3 000 r/min速率離心15 min，離心半徑為11 cm，取血清，放置于-70℃冰箱中保存待檢驗；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TGF-β水平，試劑盒選自上海酶聯(lián)生物；化學(xué)發(fā)光法檢測血清IL-6水平，試劑盒選自湖南宜樂芯康生物。

1.2.3 腸道菌群檢測方法 采集患者就診時的新鮮糞便標本1.5 g，加入4.5 mL厭氧菌稀釋液，放于渦旋振蕩器上震蕩至糞便均質(zhì)化（3 000 r/min速率下震蕩1 min），取無菌試管7個，并進行編號，分別加入9 mL稀釋液，然后從勻漿小瓶取出1 mL，放于第2管內(nèi)，充分混勻，依次類推進行倍比稀釋，至10稀釋度，將培養(yǎng)基平板放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)烘干過夜，選取合適的稀釋度進行滴種，從高稀釋度開始，每次吸取20 μL混勻的稀釋菌液，滴種于各平皿相應(yīng)的稀釋度，每個稀釋度重復(fù)3次；滴種結(jié)束后，待液滴吸收，平板反轉(zhuǎn)，分別進行需氧和厭氧培養(yǎng)，計算細菌數(shù)。細菌數(shù)=菌落數(shù)均值×50×稀釋度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。Shapiro-Wilk檢驗計量資料正態(tài)性，符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差檢驗，組間兩兩采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用百分率（%）表示；采用雙變量Kendall的tau-b（K）直線相關(guān)性檢驗血清TGF-β、IL-6水平、腸道菌群與UC患者病情程度的相關(guān)性；經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸道菌群的相關(guān)性；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UC患者病情程度評估情況

102例UC患者中，38例病情為輕度，占37.25%（38/102）；30例為中度，占 29.41%（30/102）；34例為重度，占33.33%（34/102）。

2.2 不同病情程度UC患者血清TGF-β、IL-6水平

中度組、重度組血清TGF-β、IL-6水平高于輕度組，且重度組血清TGF-β、IL-6水平高于中度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同病情程度UC患者血清TGF-β、IL-6水平比較 （±s, pg/mL）

表1 不同病情程度UC患者血清TGF-β、IL-6水平比較 （±s, pg/mL）

注：1）與輕度組比較，P<0.05；2）與中度組比較，P<0.05。

組別輕度組中度組重度組F值P值n 38 30 34 TGF-β 17.22±2.11 20.84±2.241)24.99±2.291)2)111.454<0.001 IL-6 157.00±26.22 190.32±29.231)215.10±32.681)2)35.513<0.001

2.3 不同病情程度UC患者腸道菌群情況

中度組、重度組腸桿菌、腸球菌數(shù)量高于輕度組，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量低于輕度組；且重度組腸桿菌、腸球菌數(shù)量高于中度組，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量低于中度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表 2。

表2 不同病情程度UC患者腸道菌群情況 （±s, cfu）

表2 不同病情程度UC患者腸道菌群情況 （±s, cfu）

注：1）與輕度組比較，P<0.05；2）與中度組比較，P<0.05。

組別輕度組中度組重度組F值P值n 38 30 34腸桿菌9.43±0.68 10.37±1.021)11.64±1.201)2)45.263<0.001腸球菌7.92±0.41 8.24±0.471)8.83±0.561)2)32.232<0.001雙歧桿菌8.17±0.35 7.53±0.381)6.83±0.331)2)129.986<0.001乳桿菌8.41±0.38 8.01±0.311)7.76±0.251)2)37.723<0.001

2.4 血清TGF-β、IL-6水平、腸道菌群與UC患者病情程度的相關(guān)性

經(jīng)雙變量Kendall的tau-b（K）直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，血清TGF-β、IL-6水平、腸桿菌及腸球菌數(shù)量與UC患者病情程度呈正相關(guān)（r=0.706、0.530、0.555、0.511,P均<0.05），雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量與UC患者病情程度呈負相關(guān)（r=-0.720、-0.545,P均<0.05）。

2.5 血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸道菌群的相關(guān)性

經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗，血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸桿菌及腸球菌數(shù)量呈正相關(guān)（r>0,P<0.05），與雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量呈負相關(guān)（r<0,P<0.05）。見表3。

表3 血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸道菌群的相關(guān)性

3 討論

人體腸道內(nèi)存在種類繁多、數(shù)量巨大的細菌群體，構(gòu)成了一個復(fù)雜活躍并具有廣泛生物活性的生態(tài)系，參與腸內(nèi)的分解、代謝，對維持宿主正常生理功能機及穩(wěn)定正常免疫系統(tǒng)具有重要的意義，與腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。有研究顯示，腸道菌失衡，腸桿菌、腸球菌等致病菌大量繁殖并被Toll樣受體識別，可激活腸黏膜的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致UC患者病情進展［10］。本研究觀察不同病情程度的活動期UC患者的腸道菌群情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著病情的加重，腸桿菌、腸球菌數(shù)量不斷升高，而雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量不斷降低，也證實了上述研究。其原因可能是，腸道菌群是一個復(fù)雜多樣的生物群落，其中雙歧桿菌、乳桿菌為腸道優(yōu)勢菌群，參與維護腸道上皮細胞完整性，對失調(diào)的腸道微生態(tài)群具有調(diào)節(jié)作用，其數(shù)量的降低可促使腸道菌群失衡，為致病菌增殖提供良好的環(huán)境；腸桿菌為革蘭氏陰性菌，是較為常見的致病菌，可協(xié)助致病菌通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白破壞腸道上皮屏障，同時腸桿菌產(chǎn)生的毒素因子也可導(dǎo)致腸道上皮屏障損害，進而引起腸道菌紊亂，進而導(dǎo)致腸道疾病發(fā)生、發(fā)展；腸球菌為革蘭氏陽性菌，也是一種條件致病菌，可損傷腸道上皮屏障，促進腸道疾病發(fā)生、發(fā)展［11-12］。因而，腸道菌群與UC患者的病情進展可存在一定的聯(lián)系，且本研究通過相關(guān)性分析也證實了這一推測。因此，臨床醫(yī)師可將調(diào)節(jié)腸道菌群作為臨床治療UC患者的一個靶點。

在UC發(fā)病的免疫學(xué)機制中，關(guān)于細胞因子的研究已較為廣泛與深入，腸黏膜中的細胞因子可由腸上皮細胞、巨噬細胞等分泌，可作為細胞間的信號傳遞分子在免疫系統(tǒng)與其他系統(tǒng)中充當信使的作用，形成較為完整的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)及介導(dǎo)免疫應(yīng)答等［13］。IL-6被諸多研究證實在UC發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的促炎作用，參與細胞免疫應(yīng)答，促使炎癥不斷發(fā)生、發(fā)展［14-15］。且有研究證實，IL-6也可用作反映腸道炎癥疾病的嚴重程度的重要指標［16］。本研究也證實可血清IL-6可隨著UC患者病情進展而呈升高趨勢，且與病情程度密切相關(guān)。提示了，IL-6參與UC病理過程，同時可檢測病情的嚴重程度。TGF-β是一種抑炎因子，可下調(diào)相關(guān)炎癥介質(zhì)（如腫瘤壞死因子），促進體液免疫反應(yīng)，對修復(fù)腸道黏膜具有積極的作用。但本研究中，隨著病情的進展，血清TGF-β卻呈升高趨勢，可能是由于UC發(fā)生時，機體的免疫反應(yīng)被激活，血清TGF-β升高參與抗炎反應(yīng)，但抗炎因子的過量表達，可促使機體處于免疫抑制狀態(tài)或無反應(yīng)狀態(tài)，促使病情不斷進展。且有研究指出，UC患者血清TGF-β呈高表達時，提示UC患者的TGF-β的信號傳導(dǎo)可能存在異常，導(dǎo)致其抗炎作用無法發(fā)揮作用［17］。但抗炎因子與UC發(fā)生、發(fā)展的具體關(guān)系還需進行分析。

由此可知，腸道菌群、血清TGF-β及IL-6與UC患者疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。而腸道菌群在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，故推測，血清TGF-β、IL-6可能與UC患者腸道菌群存在一定的聯(lián)系。為了驗證此推測，本研究通過相關(guān)性分析證實了這一推測。分析其機制可能是腸道致病菌的產(chǎn)物可與各自Toll樣受體結(jié)合，進而誘導(dǎo)抗原遞呈細胞分泌IL-6，可誘導(dǎo)TGF-β表達，促使免疫反應(yīng)，當血清TGF-β、IL-6過量表達，可促使機體處于免疫抑制狀態(tài)，促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致黏膜微循環(huán)障礙，削弱腸道黏膜的屏障功能，從而介導(dǎo)腸道黏膜的損傷，可導(dǎo)致腸道內(nèi)微環(huán)境進一步失衡，引起致病菌增殖、有益菌減少等［18］。由此可見，腸道菌群與血清TGF-β、IL-6可相互作用，促使UC發(fā)生、發(fā)展。但是腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致UC的原因還是結(jié)果，還需進行深入探討。

綜上所述，UC患者存在腸道菌群失衡，血清TGF-β、IL-6與UC患者腸道菌群數(shù)量存在相關(guān)性。但本研究僅證實了血清TGF-β、IL-6水平與UC患者腸道菌群的關(guān)系，但二者的具體因果關(guān)系尚未清楚，仍需進行大樣本量、前瞻性研究，為臨床診療UC提供更多參考依據(jù)。