白蛋白-奧曲肽納米顆粒制備及其緩釋性能

李昇原， 黃永鵬， 唐 慧， 汪春江， 李秀蘭， 陳 博

(1. 四川輕化工大學 機械工程學院， 四川 宜賓 644000； 2. 國民核生化災害防護國家重點實驗室， 北京 102205)

多肽藥物藥理活性好，藥效專一性高，毒副作用小，在治療疾病時具有良好的應用前景[1-2]，然而，多肽藥物存在易被酶降解、 半衰期短、 穩定性弱、 組織屏障通透性差等不足，造成在臨床應用上生物利用率低、 給藥頻繁、 患者依從性低等問題[3-5]。 納米緩釋制劑能夠提高藥物組織的滯留性和屏障穿透性，延長藥物的作用時間，進而改善多肽藥物存在的問題，是多肽藥物制劑研發的重點方向[6-8]。

人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人體血漿中含量最豐富的蛋白，由585個氨基酸構成，半衰期約為19 d，具有安全無毒、 生物相容性好、 低免疫原性等優點，是理想的藥物載體[9-10]。人血清白蛋白納米顆粒(HSA-NPs)的制備方法有反溶劑法、 自組裝法、 乳化法、 凝膠法、 納米噴霧干燥法和納米白蛋白結合技術法等。反溶劑法通過向HSA溶液中添加反溶劑來降低HSA的溶解度，使HSA從水相脫溶、析出而獲得納米顆粒，工藝簡單，制備的顆粒粒徑較小，相較于其他方法具有明顯的優勢[11-13]。

將HSA制備成納米載體并與多肽藥物結合，能顯著提高多肽藥物在體內的穩定性及活性，避免過早被機體降解清除，延長體內的釋放與作用時間[14-16]。此外，臨床研究表明，HSA與奧曲肽(octreotide, OCT)等多肽藥物聯合用藥，能夠發揮更優的治療效果[17]。目前，以HSA為載體負載多肽藥物的納米緩釋藥劑研究尚處于起步階段。

本文中利用乙醇-水反溶劑法制備HSA-NPs，比較不同交聯劑的交聯性能，探討白蛋白質量濃度、 醇水體積比、 脫溶溫度、 溶劑pH、 交聯時間等工藝參數對HSA-NPs性能的影響，獲得制備HSA-NPs的優選工藝參數；選取OCT作為多肽模型藥物，通過浸漬吸附-冷凍干燥法構建HSA-OCT微粉制劑，初步探索制劑的藥物負載與釋放效應，為研發OCT及多肽藥物緩釋制劑提供研究基礎。

1 實驗

1.1 試劑材料

藥物：人血清白蛋白(HSA，質量分數為99%，上海吉至生化科技有限公司)； 奧曲肽(OCT，質量分數為99.1%，批號為2018053003-1，浙江湃肽生物有限公司)。

交聯劑：戊二醛溶液(體積分數為50%，上海麥克林生化科技有限公司)； 1, 6-己二異氰酸酯(體積分數為99%，北京百靈威公司)； 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、 京尼平(質量分數為98%、 上海阿拉丁生化科技股份有限公司)； 葡萄糖(分析純，北京化工廠)。

其他試劑： 無水乙醇、 氫氧化鈉、 鹽酸(分析純，北京化工廠)； 乙腈、 高氯酸(色譜純，德國Merck公司)； PBS緩沖液(pH為7.4)(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 顆粒制備

1.2.1 白蛋白納米顆粒

稱取適量HSA， 溶于pH為3～11的水溶液中(用質量分數為0.1%的氫氧化鈉和鹽酸溶液調節)， 配成質量濃度為5、 10、 20、 50 g/L的HSA溶液； 以轉速為500 r/min進行攪拌， 分別按醇水體積比為1∶1、 2∶1、 2.5∶1、 3∶1、 4∶1、 6∶1、 8∶1向HSA溶液中加入反溶劑無水乙醇； 待溶液出現藍色乳光， 加入交聯劑， 反應時間分別為3、 6、 12、 24 h， 最后旋轉蒸發除去乙醇， 得到膠體溶液； 將膠體溶液在轉速為18 000 r/min條件下離心處理20 min， 并用純水洗滌， 利用LGJ-18型真空冷凍干燥儀(北京松源華興科技公司)凍干得到HSA-NPs凍干粉。

1.2.2 白蛋白-奧曲肽微粉制劑

采用浸漬吸附-冷凍干燥法制備白蛋白-奧曲肽微粉制劑。取50 mg凍干后的HSA-NPs，加入30 mL質量濃度為3.33 g/L的OCT溶液， 在室溫條件下以轉速為500 r/min攪拌12 h， 得到載有OCT的HSA-NPs混懸液； 最后將混懸液進行離心處理除去上清液， 凍干后得HSA-OCT微粉制劑。

1.3 顆粒表征

利用BT-90+型動態光散射納米激光粒度儀(丹東百特儀器有限公司)測量HSA-NPs的粒徑和多分散指數(PDI)， 對比不同時間點平均粒徑和PDI的變化情況， 研究納米顆粒的儲存穩定性； 采用ZS90型納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器有限公司)測量HSA-NPs的Zeta電勢； 使用SU8020型掃描電鏡(日本Hitachi公司)觀察HSA-NPs凍干粉和HSA-OCT微粉制劑的微觀形貌。

1.4 白蛋白顆粒的綜合評價方法

運用Z分綜合評價法，從顆粒的性能、工藝穩定性2個方面篩選最優工藝條件。顆粒性能以平均粒徑小、 PDI值低為優；工藝穩定性用多次實驗所得平均粒徑和PDI值的相對標準偏差(RSD)值表示，RSD值越小工藝越穩定。將各指標的Z分等權相加得到Z分，Z分越大評價結果越優。單個指標的Z分的計算公式為

(1)

1.5 白蛋白-奧曲肽微粉制劑的評價方法

1.5.1 載藥量測定

采用1260型高效液相色譜法(美國Agilent公司)測定HSA-NPs中OCT的質量濃度。色譜柱Eclipse plus C18尺寸為φ4.6 mm×250 mm(直徑×長度)， 色譜柱內的填料間孔徑為5 μm， 檢測波長為210 nm， 柱溫為25 ℃； 流動相中， 乙腈與質量分數為0.25%的高氯酸水溶液的體積比為30∶70，流量為1 mL/min，待檢測溶液的進樣體積為5 μL[18]。

取一定質量的HSA-OCT制劑置于離心管，加入純水溶解后超聲處理40 min并靜置一段時間，通過分析溶液中OCT的質量濃度測定載藥量。

1.5.2 藥物體外釋放性能的測定

藥物體外釋放性能參照藥物體外溶出度進行評定[19]。 取一定質量的HSA-OCT微粉制劑裝入透析袋， 加入PBS溶液至充盈透析袋， 保證藥物制劑完全潤濕； 扎緊透析袋兩端并浸沒在100 mL(溶出介質總體積)的PBS溶液中， 將裝有全部溶出介質容器置于磁力攪拌機上， 在37 ℃恒溫條件下以轉速為100 r/min進行攪拌。 按照設定的時間節點， 每次取出1 mL溶出介質后再補充1 mL新鮮介質， 分析溶出介質中OCT的質量濃度。 HSA-OCT微粉制劑的累計溶出度Q的計算公式為

(2)

式中：Ci和Cn分別為第i次和第n次最終取樣時OCT的質量濃度， g/L；m為OCT溶出總質量， mg；V1為每個時間節點取出的溶出介質體積， mL；V2為溶出介質總體積， mL。

2 結果與討論

2.1 交聯劑的選擇

HSA分子含有大量的極性基團，從水相脫溶析出的HSA-NPs不穩定，易復溶轉為水相或團聚成大顆粒[20-21]。交聯劑能連接HSA分子，穩定HSA-NPs。目前，HSA的交聯主要針對HSA游離的59個氨基[22]。

作為交聯劑的京尼平、 葡萄糖、 1, 6-己二異氰酸酯和戊二醛均能與HSA表面游離的氨基反應，交聯劑的加入質量為交聯HSA分子表面59個氨基理論所需質量的100%。在交聯過程中，EDC主要發揮活化HSA表面羧基、促使羧基與氨基偶聯的催化作用。結合文獻[23-24]和預實驗結果，EDC加入量為交聯HSA分子表面59個氨基理論所需量的10%，進一步提高EDC加入量會導致HSA分子過度交聯產生沉淀。

取1 mL質量濃度為10 g/L的HSA溶液， 攪拌狀態下加入2 mL無水乙醇， 交聯時間設為3 h， 不同交聯劑對HSA-NPs性能的影響如圖1所示。 由圖1(a)可見， 剛制備的HSA-NPs粒徑差距不大， 均小于200 nm； 儲存時間為10、 20 d以后， 未添加交聯劑或使用葡萄糖、 京尼平的HSA-NPs粒徑明顯增大， 平均粒徑大于750 nm， 添加交聯劑EDC、 1, 6-己二異氰酸酯、 戊二醛的HSA-NPs粒徑未有明顯變化。 由圖1(b)可見， 未添加交聯劑或使用葡萄糖、 京尼平作為交聯劑制備的顆粒的PDI值超過了0.25， 說明粒徑均一性較差， 添加交聯劑EDC、 1, 6-己二異氰酸酯、 戊二醛的HSA-NPs粒徑均一性較好。

(a)平均粒徑(b)PDI圖1 不同交聯劑對HSA-NPs性能的影響Fig.1 Effects of different crosslinking agents on properties of HSA-NPs

儲存10 d后不同交聯劑制得的HSA-NPs的SEM圖像見圖2。由圖(a)—(c)可知，未添加交聯劑或使用葡萄糖、京尼平作為交聯劑制備的HSA-NPs顆粒之間有明顯得團聚現象；圖(e)、 (f)分別為使用1, 6-己二異氰酸酯和戊二醛制備的HSA-NPs顆粒，由圖可知納米顆粒呈圓球狀且具有較好的分散性； 圖(d)為EDC制備的HSA-NPs顆粒，對比發現顆粒之間存在一定程度的團聚，但團聚程度弱于未添加交聯劑或使用葡萄糖、 京尼平作所制備的顆粒。

(a)無交聯劑(b)葡萄糖(c)京尼平(d)EDC(e)1, 6-己二異氰酸酯(f)戊二醛圖2 儲存10 d后不同交聯劑制得的HSA-NPs的SEM圖像Fig.2 SEM images of HSA-NPs prepared with different crosslinking agents after storage for 10 days

反溶劑法制備HSA-NPs的實質是HSA分子從水相均相成核、 長大的過程。由于納米顆粒表面能的增大，因此該過程還伴隨著顆粒的團聚現象。交聯劑不改變HSA溶液的過飽和度，因此，顆粒的粒徑及穩定性由團聚傾向決定。HSA的等電點為4.8[25]，當HSA處于非等點狀態時，其表面會附帶同種電荷。同種電荷數量越多，顆粒之間排斥力越強，就越能抵消顆粒團聚傾向，使顆粒保持穩定。交聯劑能通過改變納米顆粒表面的電荷量影響顆粒的粒徑、 分散性和穩定性。納米顆粒均帶負電荷，不同交聯劑制得的HSA-NPs的Zeta電勢絕對值如圖3所示。由圖可見，未交聯或使用葡萄糖、 京尼平交聯后HSA-NPs的Zeta電勢較小，顆粒附帶的電荷量較少，顆粒間排斥力弱，因此不穩定，易團聚；因為不穩定的顆粒易在交聯劑的作用下形成更大的顆粒，使顆粒粒徑分布更寬，所以葡萄糖、 京尼平交聯后的顆粒PDI值更大，粒徑均一性更差；1, 6-己二異氰酸酯和戊二醛交聯的納米顆粒Zeta電勢較大，顆粒具有較多的同種電荷，排斥力較強，沒有團聚現象，制備的HSA-NPs性能較好；EDC交聯的納米顆粒Zeta電勢處于中間狀態，顆粒的電荷量介于二者之間，制備的HSA-NPs存在一定程度的團聚現象。

圖3 不同交聯劑制得的HSA-NPs的Zeta電勢Fig.3 Zeta potential of HSA-NPs prepared with different crosslinking agents

表1為不同交聯劑制得的HSA-NPs的Z分評價結果。由表可以看出，EDC、 戊二醛、 1, 6-己二異氰酸酯作為交聯劑制備的HSA-NPs的平均粒徑分別為(190.0±19.45)、 (121.7±4.70)、 (122.9±7.1) nm， PDI值分別為0.13±17.18、 0.13±8.14、 0.13±19.85；Z分分別為-4.34、 -4.34、 0.40；戊二醛交聯的HSA-NPs納米顆粒的平均粒徑、 PDI值和工藝穩定性均較好，說明Z分最大的戊二醛為優選交聯劑。葡萄糖、 京尼平的交聯能力較差，不納入評價。

表1 不同交聯劑制得的HSA-NPs的Z分評價結果

2.2 白蛋白納米顆粒的優選工藝參數

2.2.1 白蛋白質量濃度

以戊二醛作為交聯劑， 設定醇水體積比為2∶1， 交聯時間為3 h， pH為7， 脫溶溫度為20 ℃， HSA質量濃度對HSA-NPs性能的影響如圖4所示。 由圖可知， 隨著HSA質量濃度的增加， HSA-NPs納米顆粒的粒徑逐漸減小， PDI值先減小后增大， 各項工藝參數的Z分則先增大后減小； 當HSA的質量濃度為10 g/L時，Z分最大為0.88，因此，根據Z分評價結果， HSA的優選質量濃度為10 g/L。

圖4 HSA的質量濃度對HSA-NPs性能的影響Fig.4 Effect of HSA mass concentration on HSA-NPs performance

根據液相均勻成核理論，顆粒的成核、 生長速率是影響粒徑及其分布的主要因素。質量濃度大的HSA溶液具有較大的過飽和度，顆粒成核、 生長速率快，所得納米顆粒小，因此HSA-NPs的平均粒徑隨HSA質量濃度的增大而逐漸減小；另一方面，質量濃度大的HSA溶液生成的顆粒較多，顆粒之間更易碰撞、 團聚，同時由于溶液的黏度較大，降低了HSA分子在水和乙醇之間的擴散速率，因此HSA-NPs的粒徑分布較寬，PDI值較大。對于質量濃度較小的HSA溶液，顆粒成核、 生長速率較慢，所需脫溶反應時間較長，使得納米顆粒的粒徑分布同樣不均勻，適中的成核速率能保證顆粒的粒徑及其分布均較優。

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2.2.2 醇水體積比

以戊二醛作為交聯劑， 設定交聯時間為3 h， pH為7， 脫溶溫度為20 ℃， HSA質量濃度為10 g/L， 醇水體積比對HSA-NPs性能的影響如圖5所示。 由圖可以看出， 當醇水體積比為1∶1時納米顆粒平均粒徑為(267.56±11.3) nm， PDI值為0.19±21.8； 醇水體積比為2∶1、 2.5∶1、 8∶1時，能獲得較小的平均粒徑，分別為(102.9±7.9)、 (86.9±24.6)、 (107.7±15.25) nm， 醇水體積比為2.5∶1、 8∶1時制備的納米顆粒的PDI值大于0.25。 醇水體積比為3∶1、 4∶1、 6∶1時平均粒徑超過了1 200 nm， 顆粒的性能較差， 不納入Z分計算范圍。 當醇水體積比為2∶1時，Z分最大為1.54， 因此， 根據Z分評價結果， HSA-NPs的優選醇水體積比為2∶1。

圖5 醇水體積比對HSA-NPs性能的影響Fig.5 Effects of volumn ratio of alcohol to water on HSA-NPs performance

醇水體積比會改變溶液的過飽和度， 從而影響體系內顆粒的粒徑、 分布情況， 不同醇水體積比制備的HSA-NPs粒徑分布如圖6所示。 由圖可見， 醇水體積比為1∶1時， 溶液產生的過飽和度較低， 顆粒成核、 生長速率慢， 制備的顆粒粒徑為100～500 nm，由于溶劑體積小，顆粒間易碰撞發生團聚，因此體系中還存在大于1 000 nm的大顆粒；醇水體積比為2∶1時，過飽和度有明顯提高，此時生成的納米顆粒粒徑為50～250 nm，粒徑分布較為集中；隨著醇水體積比進一步的增大，溶液產生的過飽和度逐漸增大，能生成更細小的粒徑小于50 nm顆粒，但小顆粒團聚傾向大，使得顆粒呈多種分散狀態；醇水體積比為2.5∶1時，開始存在明顯的團聚現象，制備的顆粒粒徑為15～700 nm，因為體系內小顆粒數量較多，所以HSA-NPs的平均粒徑小，但粒徑分布寬，PDI值大；醇水體積比達到4∶1時，顆粒的團聚傾向最大，體系存在大量的大顆粒；繼續增加醇水體積比，溶液中產生的過飽和度趨于恒定，但溶劑體積逐漸增大，降低了顆粒碰撞、 團聚的概率，因此顆粒的粒徑有所減小；當醇水體積比為8∶1時，團聚傾向明顯減弱，體系中只存在少量大顆粒。綜上，從粒徑分布情況來看，當醇水體積比為2∶1時，制備的HSA-NPs顆粒的性能最優。

(a)1∶1(b)2∶1(c)2.5∶1(d)4∶1(e)8∶1圖6 不同醇水體積比制備的HSA-NPs粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of HSA-NPs prepared with different volumn ratios of alcohol to water

2.2.3 脫溶溫度

以戊二醛作為交聯劑，設定交聯時間為3 h，pH為7，HSA質量濃度為10 g/L，醇水體積比為2∶1，將HSA溶液進行水浴，脫溶溫度對納米顆粒性能的影響如圖7所示。由圖可見，當脫溶溫度為5 ℃時，納米顆粒的平均粒徑與PDI值均較大；當脫溶溫度為10～30 ℃時，隨溫度的升高，HSA-NPs的平均粒徑逐漸增大，PDI值逐漸減小；Z分隨著脫溶溫度的升高呈現先增大后減小的變化規律；當脫溶溫度為20 ℃時，Z分最大為2.68，因此，根據Z分評價結果，HSA-NPs的優選脫溶溫度為20 ℃。

圖7 溫度對HSA-NPs性能的影響Fig.7 Effects of temperature on HSA-NPs performance

實驗發現，脫溶溫度為5 ℃時，溶液未觀察到明顯的藍色乳光，表明體系內生成的納米顆粒數量較少，低溫抑制了HSA分子脫溶析出過程。當脫溶溫度為10～30 ℃時，HSA分子能正常脫溶析出生成納米顆粒，一方面，隨著脫溶溫度的升高，溶液產生的飽和度逐漸降低，體系內顆粒成核與生長速率減緩，使得制備的顆粒平均粒徑逐漸增大，溫度通過改變HSA的溶解度而直接影響過飽和度；另一方面，溫度會影響分子的擴散速率，溫度越高分子擴散速率越快，微觀混合越充分，制備的顆粒粒徑分布就均勻。綜上，從溫度對HSA的過飽和度和擴散速率的影響來看，優選脫溶溫度為20 ℃。

2.2.4 溶劑pH

圖8 溶劑pH對HSA-NPs性能的影響Fig.8 Effects of solvent pH on HSA-NPs performance

因為HSA分子在不同pH溶液中帶電量不同，所以可以通過調節溶劑pH來改變HSA分子的靜電作用， 制備不同粒徑的納米顆粒。然而， HSA分子中的咪唑環(位于16個組氨酸上)以及末端的氨基和羧基能夠被質子化， 使其具有一定的酸堿緩沖能力[26]， 同時， 調節溶劑pH時引入的離子， 會削弱納米顆粒之間的靜電排斥力[27]， 使粒徑略大于中性溶液中的顆粒。

2.2.5 交聯時間

以戊二醛作為交聯劑，設定HSA質量濃度為10 g/L，醇水體積比為2∶1，脫溶溫度為20 ℃時， 溶劑pH為9時， 交聯時間對HSA-NPs性能的影響如圖9所示。 由圖可見， 交聯時間對顆粒的平均粒徑和PDI值影響不大； 不同交聯時間下， 顆粒的平均粒徑均小于120 nm， 分散性良好。 當交聯時間為24 h時，Z分最大為1.52， 因此， 根據Z分評價結果， HSA的優選交聯時間為24 h。

圖9 交聯時間對HSA-NPs性能的影響Fig.9 Effects of crosslinking time on HSA-NPs performance

2.2.6 優選工藝條件

綜合上述評價結果， 制備HSA-NPs的優選工藝參數為： HSA的質量濃度為10 g/L； 醇水體積比為2∶1； 脫溶溫度為20 ℃；溶劑pH為9；交聯時間為24 h。在此條件下制備的HSA-NPs工藝穩定性良好，平均粒徑為(100.6±2.5) nm， PDI為0.13±0.01。

2.3 納米顆粒的載藥量與體外釋放性能

HSA-NPs凍干粉與HSA-OCT制劑的SEM圖像如圖10所示。由圖可以看出，載藥前、 后納米顆粒的形態未發生明顯變化，保持為規則的球狀形貌，經計算，HSA-OCT微粉制劑的載藥量為1.83%。對載藥機理進行分析后發現，OCT的等電點為8.2[28]，在純水中OCT分子表面帶正電荷，因此能與帶負電荷的HSA-NPs發生靜電作用，吸附于納米顆粒表面；同時HSA分子中的α-螺旋形成了較多的網狀空隙，為OCT的吸附提供了有利空間。

(a)HSA-NPs凍干粉(b)HSA-OCT制劑圖10 HSA-NPs凍干粉與HSA-OCT制劑的SEM圖像Fig.10 SEM images of HSA-NPs freeze-dried powder and HSA-OCT preparation

HSA-OCT制劑和OCT原藥的累計溶出度隨時間的變化曲線如圖11。由圖可見，OCT原藥在累計釋放時間為120 min內時累計溶出度達到了90.6%，累計釋放時間為480 min后完全溶出；HSA-OCT制劑較OCT原藥釋放緩慢，有較明顯的緩釋作用， 藥物累計釋放時間達到2 160 min， 但時間為0～30 min時卻無藥物溶出， 可能是因為HSA-NPs的吸附能力較強， 需要經過一定時間后OCT才能釋放。

(a)0～2 500 min(b)0～60 min圖11 HSA-OCT制劑和OCT原藥的累計溶出度隨時間的變化曲線Fig.11 Curve of cumulative dissolution of HSA-OCT preparation and OCT agent changing with time

3 結論

本文中采用反溶劑法制備HSA-NPs，對比了不同交聯劑的交聯性能；研究了白蛋白質量濃度、 醇水體積比、 脫溶溫度、 溶劑pH、 交聯時間等工藝參數對HSA-NPs性能的影響；運用浸漬吸附-冷凍干燥法構建了HSA-OCT微粉制劑，分析了OCT原藥和HSA-OCT微粉制劑的體外緩釋性能。

1)交聯劑能改變HSA分子表面的靜電作用，降低HSA-NPs的團聚傾向，從而穩定固化HSA-NPs。在所選交聯劑中，戊二醛交聯的HSA-NPs納米顆粒的性能、工藝穩定性最優，制備的顆粒微觀形貌為規則球狀，儲存穩定性良好。經Z分綜合評價戊二醛為優選交聯劑。

2)HSA質量濃度、 醇水體積比和脫溶溫度對HSA-NPs的性能影響較大。 根據Z分評價結果， 制備HSA-NPs顆粒的優選工藝參數為： HSA質量濃度為10 g/L， 醇水體積比為2∶1， 脫溶溫度為20 ℃， 溶劑pH為9， 交聯時間為24 h。 在優選工藝參數參數條件下制備的納米顆粒的平均粒徑為(100.6±2.5) nm， PDI為0.13±0.01。

3)載藥前后HSA-NPs微觀形貌未發生明顯變化。相較于OCT原藥，HSA-OCT微粉制劑具有明顯的緩釋效應，持續釋藥時間為2 160 min，具有較好的體外釋放性能。