不同種植年限羊肚菌根際土壤真菌多樣性及代謝通路

韓雨潼，岳增良，張國印，郜 靜，李 玭，王立安，李守勉，趙振重，劉曉薇，王 凌

(1.河北省農林科學院農業資源環境研究所，河北石家莊 050051；2.河北省羊肚菌產業技術研究院，河北邢臺 055450；3.河北省肥料技術創新中心，河北石家莊 050051；4.河北師范大學生命科學學院，河北石家莊 050024；5.河北農業大學園藝學院，河北保定 071001；6.河北省柏鄉縣自然資源和規劃局，河北邢臺 055450)

羊肚菌屬子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，是土生類真菌，俗名羊肚菜，有“菌王之王”的美譽[1]。它富含多糖、礦物質、蛋白質、微量元素(硒、有機鍺)、氨基酸等[2]，具備極高的藥用價值和經濟價值。基于生物學特性研究，羊肚菌具有康體抗癌、促進機體免疫活性等多種作用[3-6]，由于野生羊肚菌稀缺導致羊肚菌市場供不應求、有價無市，故近年來人工栽培羊肚菌發展勢頭迅猛[7-8]。我國現有30個種類的羊肚菌，占全球總類的一半(30/61)，基于系統發育學分類：羊肚菌黑色類群13個，黃色類群17個[9-10]。目前，我國人工栽培羊肚菌成功馴化的品種主要集中在黑色類群中的六妹羊肚菌(Morchellasextelata，編號：Mel-6)、七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata，編號：Mel-7)、梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna，編號：Mel-10)[11]。

研究表明，羊肚菌生長與土壤環境密切相關[12]，然而目前針對羊肚菌根際土壤的相關研究甚少。國外羊肚菌相關研究現狀趨于在分子生物學水平上利用其生物學特性來研究羊肚菌的藥用價值[13-14]和基于系統發育學鑒定新的羊肚菌物種[15]；國內羊肚菌產業研究在野生羊肚菌及其生長土壤生境相關方面取得一些進展，最新研究進展表明，新疆昭蘇縣黑色腐質土上層(0～20 cm)羊肚菌根際微生物多樣性最豐富，且土樣中富含多種固氮菌[16]。甘肅省野生羊肚菌所處生境中，土壤含水量、養分對其根際土壤細菌優勢菌群影響程度較大[17]，速效鉀、谷氨酰胺酶與真菌優勢菌門(子囊菌門)呈顯著正相關關系[18]。

前人研究中缺乏人工栽培羊肚菌根際土壤微生物優勢菌群與環境因子的關聯性以及群落功能代謝途徑的研究。根據河北省羊肚菌產業現狀[19]，土壤生境與設施環境調控是影響羊肚菌產量的兩大因素，本研究通過對根際土壤微生物群落進行高通量測序，分析不同種植年限的土壤生境中種植羊肚菌后的微生物群落多樣性、群落組成、菌群同土壤環境因子的互作關系，以及真菌群落主要代謝途徑，為探究羊肚菌根際微環境，制定適宜河北省人工栽培羊肚菌生長的土壤生境標準提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料基本信息

供試材料采樣時間為2021年8月，試驗田位于河北省邢臺市柏鄉縣(114°70′E，37°48′N)。采樣點種植品種為六妹羊肚菌，試驗分設3組采樣：未種植羊肚菌的對照樣本(編號：CK)、種植1年羊肚菌的樣本(編號：OYC)、種植4年羊肚菌的樣本(編號：FYC)，上述土壤質地分類參照《中國土壤》[20]。分別進行根際土壤取樣[21]，每組樣品3次重復，共9個樣本，用干冰低溫保存帶回實驗室后放入-80 ℃冷凍柜儲存備用。樣本理化性質及酶活性詳見表1。

表1 樣本根際土壤理化性質及酶活性

1.2 土壤理化性質與酶活性測定方法

采用光度法測定銨態氮含量；紫外分光光度計法測定硝態氮含量；凱式定氮法測定土壤含氮量；電位法測定土壤pH值；利用電導法測定電導率；利用乙酸銨法測定土壤陽離子交換量；使用火焰原子吸收儀測定速效鉀含量；碳酸氫鈉浸提法測定速效磷含量；全磷、全鉀的含量均使用火焰光度計基于氫氧化鈉熔融法測定；有機質含量由重鉻酸鉀容量法測定；灼燒法測定有機磷含量；尿素殘留量法測定土壤脲酶活性；磷酸單酯酶活性的測定采用對硝基苯磷酸鹽法；易氧化性有機碳含量的測定基于高錳酸鉀氧化法[22-23]。

1.3 樣本DNA抽取、PCR擴增及高通量測序

使用試劑盒MP-soil抽提樣本土壤微生物群落全部DNA后，將利用1%瓊脂糖凝膠電泳提取的基因組DNA通過使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(編號：ND-2000)對其濃度進行測定；使用MiSeqPE30平臺，對真菌ITS1F_ITS2R區域利用PCR擴增引物：ITS1F(5′-C T T G G T C A T T T A G A G G A A G T A A-3′)和ITS2R(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′)[24]。PCR擴增設計：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min，停止于10 ℃。將各樣本重復3次后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其混合后的PCR產物，后采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒高效回收。

1.4 數據分析

基于統計學使用貝葉斯算法對OTU代表序列(相似水平97%)進行分類運算以獲得每個OTU對應的物種分類信息；使用Unite數據庫[25]，對微生物群落進行了α多樣性分析；利用R語言工具，分析微生物群落結構組成、屬水平物種豐度聚類分析；通過VIF方差膨脹因子分析和RDA分析，反映樣本的真菌優勢菌群與土壤環境因子之間的相關關系[26]。

2 結果與分析

2.1 羊肚菌根際土壤真菌群落多樣性及組成分析

2.1.1 羊肚菌根際土壤真菌多樣性分析 由表2可知，3組樣本的真菌群落覆蓋率都達到99.9%，極大地保證了本次數據分析結果的有效性和準確性。與未種植羊肚菌的對照樣本CK相比，種植1年的OYC和種植4年的FYC這2組樣本中真菌Ace指數、Chao1指數、Shannon指數顯著降低(P<0.05)，Simpson指數相對較高，說明種植羊肚菌后的土壤生境中真菌群落豐度、多樣性均有一定程度的降低。

表2 羊肚菌根際土壤真菌α多樣性分析

2.1.2 羊肚菌根際土壤真菌群落組成分析 門水平上，共檢測到13個真菌群落。由圖1可知，CK的優勢菌門包括子囊菌門(Ascomycota)(79.89%)、被孢霉門(Mortierellomycota)(9.38%)和擔子菌門(Basidiomycota)(6.40%)；樣本OYC的優勢菌門為子囊菌門(93.12%)、unclassified_k_Fungi(5.45%)；樣本FYC的優勢菌門僅有子囊菌門(95.60%)。各類樣本中排名第1位的優勢菌門都是子囊菌門，也是羊肚菌本身所屬的菌門，在OYC和FYC樣本中，子囊菌門的相對豐度與CK相比，分別增加了13.23百分點和15.71百分點。說明隨著種植年限增加，子囊菌門的菌群豐度逐年提升。

由圖2可知，綱水平上，共檢測到42個真菌群落。糞殼菌綱(Sordariomycetes)(53.35%)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)(9.38%)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)(9.15%)是CK的優勢菌綱，樣本OYC的優勢菌綱包括糞殼菌綱(59.85%)、座囊菌綱(Dothideomycetes)(15.71%)和散囊菌綱(10.00%)，樣本FYC的優勢菌綱為糞殼菌綱(68.75%)、散囊菌綱(9.17%)。各類樣本中排名第1位的優勢菌綱均為糞殼菌綱，其相對豐度在OYC和FYC樣本中較CK，分別提升了6.50百分點和15.40百分點。說明隨種植年限增加，糞殼菌綱的菌群豐度逐年提升。

2.2 羊肚菌根際土壤真菌群落聚類分析

對3組樣本基于屬水平進行物種分類，選擇總豐度前20的物種，依據相對豐度將其分塊聚集，并結合物種所屬的綱水平更為明晰地展現優勢菌群。被孢霉屬(Mortierella)作為CK的優勢菌屬，它隸屬于被孢霉綱，且相對豐度為9.15%。樣本OYC的優勢菌屬為擬棘殼孢屬(Pyrenochaetopsis)，隸屬于座囊菌綱，相對豐度為12.05%。樣本FYC中的優勢菌屬新赤殼屬(Neocosmospora)、毛殼菌屬(Chaetomium)，同屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)，相對豐度分別為16.43%、13.46%。說明3組樣本的優勢菌屬具有很大差異性，且各組樣本優勢菌屬的相對豐度都高于其他2組該菌屬的相對豐度(圖3)。

2.3 羊肚菌根際土壤真菌優勢菌群與土壤環境因子相關性分析

2.3.1 VIF方差膨脹因子分析 在RDA分析之前，首先將土壤環境因子進行VIF方差膨脹因子分析，篩選后保留多重共線性較小的土壤環境因子(VIF<5)為速效鉀含量、磷酸單酯酶活性、有機質含量、含水率、銨態氮含量和速效磷含量(表3)。

表3 VIF方差膨脹因子分析篩選后的VIF

2.3.2 真菌與土壤環境因子的冗余分析 選取相對豐度前5的真菌優勢菌門，且土壤環境因子對其影響程度表現為含水率>銨態氮含量>有機質含量>速效磷含量>速效鉀含量>磷酸單酯酶活性。優勢菌門排名第1位的子囊菌門與速效鉀含量、速效磷含量、銨態氮含量、含水率呈正相關關系，且與速效磷、速效鉀含量顯著正相關，而與磷酸單酯酶活性、有機質含量呈顯著負相關關系；分別排在第2、3位的被孢霉門和擔子菌門均與含水率、磷酸單酯酶活性呈正相關關系，與銨態氮含量等其他4個環境因子呈負相關關系，捕蟲霉門(Zoopagomycota)與銨態氮含量、速效磷含量、速效鉀含量呈正相關關系，而與含水率、有機質含量、磷酸單酯酶活性呈負相關關系(圖4)。

2.4 羊肚菌根際土壤真菌群落代謝通路分析

通過FUNGuild對真菌進行功能分類，主要功能是腐生真菌代謝，說明腐生營養型真菌大量存在，其主要作用是加速土壤腐殖質的形成和分解，促進碳、氮循環。各樣本功能預測中排名第1的均是未定義的腐生真菌(Undefined Saprotroph)，其相對豐度在CK、OYC、FYC樣本中分別是23.57%、29.77%、38.77%，OYC、FYC樣本與CK相比，其相對豐度分別增加了6.20百分點、15.20百分點，說明種植羊肚菌更能促進腐生真菌代謝效率(圖5)。

通過PICRUSt2對ITS測序數據進行功能預測和豐度統計，由圖6可知，各樣本中相對豐度最高的是EC編號為3.6.1.3的酶，基于brenda酶數據庫(BRENDA Enzyme Database，https：//www.brenda-enzymes.info)進行查詢統計，三磷酸腺苷酶(酶編號：EC3.6.1.3，簡稱ATPase)，屬于水解酶，作用于酸酐，在含磷酸酐中，催化水解三磷酸腺苷(ATP)，產物為二磷酸腺苷(ADP)和無機磷酸，即為羊肚菌提供土壤生長環境中可吸收的無機磷。

3 討論與結論

早期研究表明，植物根際是一個動態環境，植物種類和土壤類型兩大主要因素決定作物根系附近微生物群落結構，且根際微生物群落組成與植物互相影響[27-29]。羊肚菌作為草腐菌，不同于木腐菌生長與林木具有菌根關系[30]，而人工栽培羊肚菌，缺乏森林、草木等多元環境，必然更多受到土壤理化性質、微生物優勢菌群等多種自然因素及人為施用農田投入品因素的影響。本次研究結果表明，在北方pH值呈堿性土壤中種植羊肚菌不同年限后，其根際土壤真菌菌群組成發生變化，物種多樣性大幅降低，相較于陳誠等在四川酸性土壤中得出的羊肚菌栽培后真菌多樣性降低的結論[31]，說明種植羊肚菌后真菌多樣性降低這一結果可能與土壤pH值沒有直接關聯。未種植羊肚菌時，優勢真菌門包括子囊菌門、被孢霉門及擔子菌門，而種植羊肚菌后，隨著年限增長，子囊菌門趨向于最優勢菌群。通過對比趙玉卉等在甘肅野生羊肚菌根際土壤樣本中得出的優勢菌群為子囊菌門和擔子菌門[18]這一結論，表明在野生羊肚菌與人工栽培羊肚菌這2種不同生境中，羊肚菌所在的子囊菌門始終占優勢，且其下的糞殼菌綱隨種植年限增長，其優勢型亦更為明顯，表明土壤中的真菌多樣性隨種植年限的增加而逐漸趨于單一化。

已有研究表明，羊肚菌子實體生長需要大量養分攝入，保持土壤中氮、磷等元素的平衡可促使羊肚菌出菇[32-33]。本次研究結果表明，含水率、銨態氮含量、有機質含量、速效磷含量、速效鉀含量、磷酸單酯酶活性這些土壤環境因子對羊肚菌生長確實具有顯著影響，且速效磷、速效鉀含量與羊肚菌所在的子囊菌門呈顯著正相關關系，而磷酸單酯酶活性、有機質含量與其呈顯著負相關關系。目前，報道的研究成果中，閻威文等研究發現，影響吉林遼源地區羊肚菌根際真菌優勢菌群的最重要的土壤環境因子是全氮、有機碳[34]。全氮是土壤當中全部的氮養分，而銨態氮是土壤中無機氮里最易被作物直接吸收的活性氮，故本研究結果有更進一步的細化，同時也作為甘肅野生羊肚菌根際土壤中子囊菌門與速效鉀含量、谷氨酰胺酶活性、脲酶活性等呈正相關關系這一結論的差異對比及內容補充[18]。

在同一地塊連續多年種植羊肚菌后，腐生真菌隨著年限增長，土壤中腐生營養型真菌相對豐度增長了6.20百分點(樣本OYC)、15.20百分點(樣本FYC)，腐生真菌易攜帶病原體，說明土壤病蟲害隱患增加，故在田間管理中需注意土傳病害感染的預防，應選擇適宜的土壤調理劑品類，在今后的研究中將作進一步探究。且真菌功能作用的主要代謝途徑為三磷酸腺苷酶(ATPase)通過催化水解釋放能量的過程，即轉化營養物質供羊肚菌吸收。ATP酶配體相互作用，土壤中有機物對酶活性產生抑制或活化作用，基于功能預測結果中腐生真菌的大量衍生，可以猜測腐生真菌對ATP酶具有活化作用。

綜上，本研究作為人工栽培羊肚菌根際土壤相關研究的重要發現，探討了土壤環境與種植年限導致羊肚菌根際土壤真菌群落多樣性與群落組成變化，發現了人工栽培過程中對真菌優勢菌群最具影響的土壤環境因子，明確了真菌優勢菌群主要功能及酶代謝途徑，對今后河北省羊肚菌人工栽培管理措施的標準化制定具有重要意義。