高溫背景下晝夜溫差對葡萄葉片光系統Ⅱ及抗氧化酶活性的影響

高 芮，韓 瑋，楊太明，陳金華，武 瓊

(1.南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇南京 210044；2.陜西省旬邑縣氣象局，陜西旬邑 711300；3.安徽省農業氣象中心，安徽合肥 230031)

葡萄(Vitisvinifera)屬多年生落葉藤本植物，設施葡萄栽培經濟效益高、發展前景廣闊。根據農業農村部市場與信息化司的統計數據，截至2020年，中國葡萄的栽培面積達1 570萬hm2。近年來，中國南方夏季的氣溫屢破新高，最高氣溫甚至可能突破40 ℃。這種高溫天氣對葡萄的生長發育構成了相當大的挑戰。因此，研究葡萄在高溫下光合生理機制的變化，對于合理調控大棚溫室溫度、減少高溫危害、促進葡萄生長發育與高產、提高經濟效益具有十分重要的意義。近年來，大部分學者對葡萄的研究集中在高溫脅迫方面。如Kalaji等研究發現，高溫脅迫會導致植物葉片光合系統受損、光合物質生產能力下降[1]；Müller等了解到，當植物受到高溫脅迫時會產生大量活性氧類成分[2]；查倩等研究發現，夏黑葡萄對高溫逆境有較強的適應能力[3]。晝夜溫差作為環境控制因子也受到了國內外學者的關注，在作物生育期內，晝夜溫差會顯著影響黃瓜、番茄、辣椒等經濟作物的干物質積累和分配，也會影響其葉面積及株高[4-8]。Ingunn等證實，當晝夜溫差為-6 ℃時，薄荷葉片的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)含量均降低，光合速率也明顯低于晝夜溫差為正值的處理[9]。樸弦春等認為，7 ℃的晝夜溫差會促進馬鈴薯苗的光合作用，有利于植株生長[10]。Bertamini等研究發現，晝夜溫差愈大，葡萄葉片中的酶活性、可溶性蛋白含量及光系統活性愈高[11]。

以上研究結果表明，前人的研究多集中在晝夜溫差對植物生理生化特性的影響上，然而對高溫條件下不同晝夜溫差對植物光合特性等生理指標影響的研究較少。為了探究高溫條件下不同晝夜溫差對葡萄葉片光合特性的影響，本研究擬通過人工環境控制試驗，在高溫背景下設計4個不同晝夜溫差的處理，研究不同晝夜溫差對葡萄葉片葉綠素熒光動力學、抗氧化酶活性等參數的影響，以期為我國設施葡萄種植的溫度精準調控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2020年4—5月在南京信息工程大學農業氣象實驗站完成。以二年生葡萄品種藍寶石為材料，將葡萄植株于4月初定植于高40 cm、直徑 40 cm 的塑料盆中，植株高約60 cm。供試土壤為中壤土，pH值為7.4，有機質含量為18.41 g/kg，全氮含量為0.86 g/kg，全磷含量為0.75 g/kg，有效鉀含量為280 mg/kg。植株進行正常水肥管理，5月初將處于生長期的盆栽葡萄植株移入氣候箱內。

1.2 試驗設計

在人工氣候箱(型號：PGC-FLEX，品牌：Conviron，產地：加拿大)中進行不同晝夜溫差試驗。設定日均溫為30 ℃，晝/夜溫度分別設如下4個處理：38 ℃/22 ℃(16 ℃晝夜溫差)、36 ℃/24 ℃(12 ℃ 晝夜溫差)、34 ℃/26 ℃(8 ℃晝夜溫差)、32 ℃/28 ℃(4 ℃晝夜溫差)。以晝/夜溫度為 30 ℃/30 ℃的處理作為對照(CK)；晝—夜光照周期為12 h—12 h，每天06：00—18：00光照，光照度為800 μmol/(m2·s)；空氣相對濕度設置為65%～75%，CO2濃度設置為400 mg/L。在人工氣候箱中處理7 d后測定葉片的各項試驗指標，每個指標重復測定3次，取平均值作為試驗結果。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 熒光參數的測定 使用Pocket PEA(Hansatech，UK)型植物效率分析儀對葡萄無病蟲害的功能葉片進行測定。測定前先用暗適應夾夾住葉片，暗適應15 min后開始測定，每個處理重復測定3次。Pocket PEA能夠得到PSⅡ詳細的信息。通過對OJIP曲線上的參數分析得出PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)和PSⅡ供體側、受體側及PSⅡ反應中心功能的參數，以參數Wk表示PSⅡ供體側受傷害程度，以參數ψEo表示PSⅡ受體側電子傳遞的功能；用天線色素吸收的能量(ABS/RC)、用于電子傳遞的能量(ETO/RC)、用于熱耗散的能量(DIo/RC)來分析能量的分配情況。

1.3.2 葉綠素含量的測定 參照張立軍等的方法[12]，選取生長良好的功能葉片(從底部老葉起第5～7節位)，將葉片浸泡在95%乙醇中，避光直至葉片變白，用分光光度計在665、649、470 nm波長下對提取液進行比色，計算出葉片的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)含量。

1.3.3 保護酶活性的測定 根據李合生等的方法[13]配制并定容超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)溶液。

SOD活性的測定：配制母液和SOD反應液，在560 nm下進行比色，從而計算出SOD總活性，以抑制氮藍四唑(NBT)光化還原50%的酶量為1個酶活性單位。

POD活性的測定：配制0.1 mol/L pH值為6.0的磷酸緩沖液和POD反應液，在470 nm下進行比色，用1 min內吸光度的變化值表示酶活性的大小。

CAT活性的測定：配制CAT反應液，240 nm下進行比色，以1 min內吸光度的變化值表示酶活性大小。

1.3.4 丙二醛和可溶性蛋白含量的測定 根據李小方等的方法[14]測定丙二醛含量，先配制丙二醛反應液，然后在600、532、450 nm 3個波長下進行比色，根據比色結果計算丙二醛含量。再根據劉貴巧等的方法[15]測定可溶性蛋白含量，在595 nm下進行比色，繪制標準曲線，計算出可溶性蛋白含量。

1.4 數據處理

使用SPSS 26.0進行相關分析、主成分分析，使用Origin Pro 2021進行圖表繪制，運用單因素方差分析(one-way ANOVA)的0.05水平的Duncan’s多范圍測試(DMRT)對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 晝夜溫差對葡萄葉片最大光化學效率的影響

由圖1可知，CK處理的Fv/Fm最高，穩定在0.80，不同晝夜溫差下葡萄葉片Fv/Fm與CK處理相比差異均達顯著水平，說明在高溫背景下，晝夜溫差的增加和晝溫的升高會抑制PSⅡ的活性，從而降低葡萄葉片的潛在最大光合能力。

2.2 晝夜溫差對葡萄葉片光系統Ⅱ(PSⅡ)能量分配的影響

由圖2-a可知，當晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃時，ABS/RC隨著晝夜溫差的增大而顯著下降。由圖2-b可知，ETO/RC隨著晝夜溫差的增大呈現出先上升后下降的趨勢，晝溫/夜溫為34 ℃/26 ℃處理的ETO/RC顯著高于CK處理，其他處理的晝溫/夜溫與CK處理間并無顯著差異。由圖2-c可以看出，DIO/RC隨著晝夜溫差的增大而呈現出顯著上升的趨勢，DIO/RC在晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理下最大，是CK處理的3.08倍。

2.3 晝夜溫差對葡萄葉片PSⅡ供體側、受體側的影響

Wk表示受體側放氧復合體受傷害的程度，Wk升高則表示供體側受到傷害；ψEo表示PSⅡ用于電子傳遞的量子產額。由圖3-a可以看出，隨著晝夜溫差增大，晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃和36 ℃/24 ℃處理的Wk與CK處理相比無顯著差異，而晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理的Wk顯著高于CK處理，是CK處理的1.27倍。由圖3-b可以看出，經過不同晝夜溫差處理后，隨著晝夜溫差的增大，晝溫/夜溫為36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃處理的ψEo較CK處理顯著上升。晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理的Wk與CK相比上升了27%，ψEo與CK處理相比上升了13%，因此晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理中供體側的受損害程度大于受體側。

2.4 晝夜溫差對葡萄葉片光合色素含量的影響

由圖4可以看出，在不同晝夜溫差處理下，Chl a含量呈先下降后上升的趨勢，但均大于CK處理，即在不同晝溫/夜溫處理下，葡萄葉片的Chl a含量排序為38 ℃/22 ℃>36 ℃/24 ℃>32 ℃/28 ℃>34 ℃/26 ℃。Chl b含量隨著晝夜溫差的增大而呈現上升趨勢，晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃處理的Chl b含量分別是CK處理的1.21、1.70、1.92、2.50倍。在不同晝夜溫差處理下，Chl b含量的增幅大于Chl a含量的增幅，這也說明隨著晝夜溫差的增加，Chl a、Chl b含量均增大，Chl a和Chl b含量的比值逐漸減小。

2.5 晝夜溫差對葡萄葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5可以看出，在高溫條件下，不同晝夜溫差模式的葡萄葉片SOD活性隨晝間溫度的升高而增加，晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃處理的葡萄葉片SOD活性分別是CK處理的1.37、1.54、1.63、1.81倍。葡萄葉片的POD活性隨著晝間溫度的升高而增加，晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃處理的POD活性分別是CK處理的1.92、3.71、7.27、8.47倍。葡萄葉片的CAT活性隨晝間溫度的升高而增加，溫度越高，CAT活性的變化速率越大，晝溫/夜溫為32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃、38 ℃/22 ℃處理的CAT活性分別是CK處理的3.12、9.17、12.87、15.72倍。

2.6 晝夜溫差對葡萄葉片丙二醛、可溶性蛋白含量的影響

由圖6-a可以看出，葡萄葉片的丙二醛含量在不同晝夜溫差處理后增加，CK處理的丙二醛含量為0.010 μmol/g。經不同晝夜溫差處理后，丙二醛含量增加到0.012 μmol/g左右。晝溫/夜溫為 38 ℃/22 ℃處理的丙二醛含量達到最大值，顯著高于CK處理。

由圖6-b可知，經過不同晝夜溫差處理后，葡萄葉片的可溶性蛋白含量隨晝溫的增大而增加，晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理的可溶性蛋白含量達到9.45 μmol/g，顯著高于CK處理。晝溫/夜溫為 32 ℃/28 ℃、34 ℃/26 ℃、36 ℃/24 ℃和38 ℃/22 ℃ 處理的可溶性蛋白含量分別是CK處理的1.43、2.04、2.50、2.69倍。

2.7 晝夜溫差下各指標相關性分析

由表1可知，晝間溫度與各生理參數存在不同程度的相關性，與Fv/Fm、ABS/RC呈極顯著負相關，與DIO/RC、SOD活性、CAT活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量呈極顯著正相關，與Chl a含量、POD活性呈顯著正相關。晝夜溫差與ψEo呈極顯著正相關，與Wk、POD活性呈顯著正相關。而夜間溫度與所有理化指標均無顯著相關關系。

表1 晝間溫度、夜間溫度及晝夜溫差與葡萄葉片生理參數的相關性分析

2.8 不同晝夜溫差下各指標的主成分分析

對所有生理指標進行主成分分析，結果(表2)表明，第1主成分以丙二醛含量、POD活性、可溶性蛋白含量為主，特征根為10.974，累計貢獻率為84.418%；第2主成分以ETO/RC為主，特征根為1.301，累計貢獻為94.425%。由此可見，第1主成分、第2主成分足夠描述晝夜溫差下葡萄葉片的所有生理指標。

表2 葡萄葉片熒光生理指標的主成分分析成分矩陣

根據各處理的主成分指標，由主成分總解釋方差、成分矩陣計算出葡萄葉片在高溫背景下不同晝夜溫差處理的綜合得分，得分越偏離CK處理，表明葉片受到的損害越大。如表3所示，不同處理的綜合得分表現為CK<32 ℃/28 ℃<34 ℃/26 ℃<36 ℃/24 ℃<38 ℃/22 ℃，由此可以推測，在晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理下，葡萄葉片受到的損害最大。

表3 不同處理葉片的主成分分析綜合得分

3 討論與結論

葡萄葉片的發育不僅與溫度密切相關，還與光照、水分及土壤肥力等有關。本試驗在人工氣候箱內進行，光照、濕度、水分等環境條件一致，因此僅考慮不同高溫模式對葡萄葉片的熒光特性、葉綠素、抗氧化酶等參數的影響。

Fv/Fm是PSⅡ最大光化學效率，可用來度量葉片的原初光能轉化效率。本研究結果表明，在不同處理模式下，隨著晝溫升高，晝夜溫差變大，晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理的Fv/Fm較CK處理顯著降低，表明晝間高溫會導致PSⅡ反應中心活性降低。ABS/RC、ETO/RC、DIO/RC是研究植物受高溫脅迫時的重要參數。在逆境下，植物會通過調節能量分配的方式來提高適應性[16]，在不同晝夜溫差處理下，反應中心的能量分配參數也有明顯變化。本研究結果表明，隨著晝夜溫差的增大，ABS/RC顯著下降，這表明晝間高溫增大使得葡萄葉片吸收的光能減少，用來還原QA激發能的能量增加；ETO/RC呈現先上升后下降的趨勢，說明隨著晝夜溫差的增大，用于光合電子傳遞的能量減少；葉片的DIO/RC隨著晝夜溫差的增大而逐漸上升，說明葉片在晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理下，晝間高溫耗散大量的激發能，保護光合電子傳遞鏈不被過剩的激發能破壞，進而減輕過多的激發能對PSⅡ反應中心的傷害[17]，在一定程度上保護了電子傳遞鏈。

快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)同樣可以得到更多的PSⅡ光化學信息，如PSⅡ供體側、受體側的變化。Wk參數是放氧復合體(OEC)即 PSⅡ 供體側受傷害程度的重要指標[18]。本研究結果表明，在16 ℃溫差處理下，Wk顯著升高，表明光合電子傳遞鏈傳遞效率降低，OEC功能受到抑制，PSⅡ供體側受到的傷害隨著晝間溫度的升高而增大。ψEo也隨著晝夜溫差的增大而增加，說明反應中心受體側受到傷害，受體側的電子傳遞受阻，反應中心流向受體側的電子的減少，但相對于供體側而言，受體側的活性降低程度較小[19]。當供體側的受傷害程度大于受體側的受傷害程度時，Wk繼續升高；當受體側的受傷害程度大于供體側的受傷害程度時，Wk不再顯著升高[20]。由此可以看出，在 16 ℃ 溫差處理下，葡萄葉片的供體側受傷害程度大于受體側。經過相關分析得出，晝間高溫對葉片供體側、受體側的影響較大。在16 ℃溫差處理下，Wk、ψEo的增大在一定程度上說明PSⅡ供體側的OEC功能受到了損害以及PSⅡ受體側由QA到QB的電子傳遞受阻。

葉綠素含量通常能夠反映葉綠體的發育和光合性能[21]，Chl a、Chl b在植物葉片中的主要作用是捕捉和傳遞光能。本研究結果表明，在日均溫相同、不同晝夜溫差模式處理下，葡萄葉片的Chl a、Chl b含量都較CK處理顯著提高，并且Chl b含量的增加幅度大于Chl a；晝夜溫差越大、晝溫越高，葉綠素含量的增幅越大，這與楊再強等的研究結果[22-23]一致；葉綠素含量的增加可以有效提升植物捕獲光的能力，促進光能的傳遞，進而促進光合速率的提高。

綜上所述，在高溫條件下，晝間溫度的升高會抑制葡萄葉片的光合能力，主要體現在：PSⅡ反應中心結構受損和電子傳遞受阻，在16 ℃溫差處理中抑制作用明顯增加，并且供體側受損害程度大于受體側。通過相關分析得出，晝間溫度對DIO/RC、SOD活性、CAT活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量有極顯著影響，晝夜溫差與ψEo呈極顯著正相關關系，可知植物的受傷害程度主要取決于晝間溫度。主成分分析結果顯示，晝間溫度越高，葉片的受損害程度越深，晝溫/夜溫為38 ℃/22 ℃處理的高溫脅迫最為嚴重。