高粱類缺鉀癥狀種質礦質元素含量分析及基因定位

朱振興，曲匡正，李 丹，王春語，白春明，陸曉春

(遼寧省作物分子改良重點實驗室/遼寧省農業科學院高粱研究所，沈陽遼寧 110161)

高粱是全球五大作物之一，在我國也是重要的雜糧作物[1]。高粱具有耐瘠薄、耐旱、耐鹽等特性，一般種植于邊際土地上，對利用瘠薄、干旱、鹽堿的土地有重要影響[2]。另一方面，高粱在我國白酒釀造、國民膳食結構調整及扶貧工作中占有重要地位[3]。鉀是植物三大重要元素之一，是植物細胞中主要的無機離子，在干質量中最高能占10%[4]。鉀離子在植物體內作用廣泛，對植物的生長、發育、代謝、抗性等方面都有重要影響。鉀離子參與一些酶的激活、維持蛋白的合成、細胞質內的pH值的動態平衡等過程[5]。還參與韌皮部運輸有機溶液，如參與蔗糖從地上運輸到根部的過程中，或是運輸到果實等一些“庫”組織的過程中起重要的作用[6]。在調節細胞膨壓、調控滲透壓的變化、維持細胞電荷平衡，影響細胞的生長，影響細胞對環境的反應，如氣孔運動、向光性、向地性和細胞伸長等[7]。

根系是植物吸收鉀的主要組織器官，從根系表皮和皮層細胞吸收鉀，然后運輸到中柱，通過中柱將鉀養分輸送到需要的組織和器官[8]。由于脂質雙層細胞膜是不可滲透離子，所以鉀必須通過膜上的特異轉運蛋白才能進入根中[9]。現在一般認為高親和性鉀吸收系統主要是由質膜上的鉀轉運體參與，如HAK5鉀離子轉運體[10]，可能也有離子通道參與；而低親和性鉀吸收系統主要是質膜上的鉀離子通道，如離子通道蛋白AKT1[11]，一般被認為是被動運輸過程，不需要消耗ATP。位于膜上的鉀離子通道可能構成了低親和性鉀吸收系統[12]。另一方面，鉀吸收系統也受轉錄水平及轉錄后水平調控。鉀離子的吸收利用分子機制在水稻中和擬南芥中有相對深入的研究，但在高粱中基本不清楚[13]。鉀肥相對價格較貴，當季利用率約為50%[14]，其余的鉀肥被浪費并排放到環境中，不經濟也不環保。作物缺鉀時，葉片上一般可見發黃、褐色斑點，葉尖、葉緣呈現褐色小斑點，然后逐步褐變枯死，而且老葉比新葉癥狀更嚴重，最終嚴重影響產量。因此通過鑒定類缺鉀突變體或種質，發掘與鉀吸收利用相關的基因，對培育鉀養分高效高粱有重要作用。

一般鉀吸收利用分子途徑知識來自突變體研究較多，而自然種質的報道較少。從國際半干旱作物研究所引進的高粱核心種質資源中[15]，有1份高粱種質編號8-10在拔節后，葉尖及葉片邊緣逐漸出現紫褐色斑點，然后逐步壞死，類似于缺鉀癥狀。而正常生長的高粱葉片在籽粒成熟之前一般并不會產生紫褐色壞死斑點。從2012—2015年連續3年的田間正常種植條件下，表型觀察高粱種質 8-10 葉片的表現穩定、一致，因此確定這是一份特異的類缺鉀癥狀種質資源。本研究對高粱類缺鉀癥狀種質8-10進行表型和不同位置葉片進行礦質含量的分析，組配F2群體，研究該性狀的遺傳特性，并通過BSA-Seq高通量測序對該性狀控制基因進行粗定位。

1 材料與方法

1.1 材料與田間種植條件

高粱微核心種質材料8-10，以參考基因組測序品種BTX623作為參照品種。田間種植條件，為一般高粱田間種植條件，正常進行澆水、施肥、病蟲害管理等。種植行距為40 cm，株距為20 cm，行長為 2 m。

1.2 礦質含量測定

在開花時期，取BTX623以及8-10不同位置的新鮮葉片，每個位置葉片取2株長勢基本一致植株同位置的葉片混在一起，計為1個樣品，3個生物學重復，即將6株苗的葉片進行烘干至恒質量。烘干過程如下，新鮮葉片首先120 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘至恒質量，一般4 d即可。在進行礦質含量分析時需要注意的是，要用陶瓷剪刀將樣品進行剪碎(避免鐵元素或其他金屬元素污染)。取碎的混勻干樣葉片約0.1 g，加入6 mL濃硝酸和2 mL濃H2O2(濃度一般為30%)，過夜預硝化，然后用微波硝煮儀(美國CEM公司MARS6)按照說明書進行消化至澄清液體，冷卻后開蓋，其后對消化管進行趕酸至體積約0.5 mL，最終定容至25 mL，采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)(美國珀金埃爾默公司Optima 8000)進行礦質元素含量的測定。

1.3 基因組DNA提取以及BSA-Seq高通量測序分析

首先進行定位群體的構建，將葉片顏色正常品種BTX623與8-10類缺鉀癥狀種質進行雜交獲得F1，然后套袋自交得到F2。將F2群體植株種植于田間，正常施肥管理。在田間F2群體開花后大概2周，采集葉片顏色正常的表型植株50株，典型類缺鉀癥狀葉植株50株，以及父母本2個材料進行基因組DNA提取。由于高通量測序對基因組DNA條帶質量要求高，DNA提取采用試劑盒法(天根生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒DP320)，所用新鮮葉片大概100 mg，按照說明書進行提取，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，要求條帶清晰、無拖尾；用核苷酸紫外分光光度計Nanodrop測定DNA的濃度(美國賽默飛世爾科技公司)以及D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，確保比值在1.8～2.0之間。BSA-Seq測序時2個DNA混池要求均勻混合每個樣品，每個樣品濃度要求大于50 ng/μL，總量為100 ng，然后將檢驗合格的DNA樣品送樣至北京百邁克生物科技有限公司進行高通量測序分析。

本研究利用北京百邁客生物科技有限公司自主研發的特異性位點擴增片段測序(specific locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)技術[16]對高粱類缺鉀癥狀F2遺傳分離群體(2個親本和50+50的混池)進行關聯分析，最終獲得與類缺鉀性狀緊密關聯的分子標記和候選區域。SLAF高通量測序分析流程簡述如下：首先通過高粱基因組進行方案預測，選擇HaeⅢ+RsaⅠ 酶進行酶切，SLAF標簽長度選擇在364～414 bp 之間，預測到113 111個SLAF標簽，SLAF標簽在基因組上基本分布均勻，位于重復序列區的SLAF標簽比例為8.77%。酶切完后進行建庫，基因組DNA片段經過加接頭、PCR擴增等，然后進行上機測序，其后進行生物信息學分析。對獲得的原始數據進行接頭序列等序列的過濾，然后得到clean data，利用BWA軟件進行比對到參考基因BTX623上，然后進行單核苷酸多態性(SNP)位點的檢測，依據檢測出的SNP位點，計算SNP-index差值，主要是尋找混池之間基因型頻率的顯著差異，用Δ(SNP-index)統計。標記與性狀關聯度越強，Δ(SNP-index)越接近于1。最終挑出顯著差異的區域，定位候選區域。

2 結果與分析

2.1 高粱8-10葉片表型觀察

由于該種質來源于國際半干旱作物研究所引進的高粱核心種質資源，在對照方面，選取BTX623參考基因組測序品種作為比較對象。高粱8-10種質在苗期拔節前，葉片上幾乎無紫褐色壞死斑點，與其他品種如BTX623并無顯著差異。之后葉尖、葉片邊緣逐步出現紫褐色壞死斑點，到了開花后葉片中就出現了大量紫褐色壞死斑點；在老葉中越來越多，而且是從葉尖到邊緣逐漸壞死。如圖1所示，旗葉到第7葉，紫褐色壞死斑點呈現增多的趨勢，特別是新葉中少，老葉中多。而一般的高粱種質葉片如參照品種BTX623品種在此時期葉片不論是旗葉還是其他位置葉片葉尖、葉緣都沒出現紫褐色壞死斑點。

2.2 高粱8-10不同位置葉片礦質含量分析

由于高粱8-10種質葉片葉尖、葉緣出現紫褐色壞死斑點，類似于缺鉀的癥狀，而且符合老葉癥狀嚴重，新葉輕的特性。為驗證該紫褐壞死斑點的產生是否與礦質元素含量的影響有關，特別是那些可移動的礦質元素，如鎂、鉀、鈣、磷、鈉、鐵、錳、銅等。將8-10與BTX623最上面的3片葉片中礦質元素含量(旗葉為L1，往下依次為L2、L3)進行比較可知，鉀、鎂以及鈣元素在3個葉片之間的變化趨勢與BTX623有較大的不同，鉀含量在8-10倒3葉中較倒2葉降低了25.3%；而鎂、鈣離子的積累模式與BTX623葉也不同，特別是在倒3葉中較倒2葉中分別增加了72.1%以及57.8%；其他元素如磷、鈉、鐵等元素在不同葉片中的分布模式與BTX623差異并不明顯(圖2)。

2.3 遺傳分析

將高粱類缺鉀種質8-10與BTX623進行雜交獲得F1，F1植株葉片表現正常，無褐紫色壞死斑點，表明該性狀控制基因屬于隱性控制基因。F1自交得到F2群體，播種于田間并進行表型的觀察。在植株開花后約10 d，進行褐紫色壞死斑點的統計。將葉片上的褐紫色壞死斑點的數量分為4個等級：1級，葉片無或幾乎無褐紫色壞死斑點；2級，葉片中少量褐紫色壞死斑點；3級，中等量褐紫色壞死斑點；4級，褐紫色壞死斑點數量與8-10種質相似。在F2中進行褐紫色壞死斑點性狀等級調查，結果表明，葉片表現為無或幾乎無褐紫色壞死斑點的植株有349株(W型)，而攜帶褐紫色壞死斑點的植株3個類型合計為312株(B+、B++以及B+++)。葉片W型植株與葉片攜帶B型的植株數量進行9∶7分離比例的Pearson卡方測試，結果表明P值大于0.05，符合9∶7分離比例(表1)。該分離比例表明，褐紫色壞死斑點控制基因受2對隱性基因控制。但在有褐紫色壞死斑點斑點的植株中，并不符合2個沒有相互作用的隱性基因的遺傳規律，表明這2個基因之間很可能是存在互作關系的。

表1 F2群體葉片斑點的遺傳分析結果

2.4 BSA-Seq高通量測序分析

在高粱類缺鉀種質8-10與BTX623進行雜交獲得的F2群體中，挑選極端表型個體各50株，即50株F2植株中葉片表型與8-10一致，50株F2植株葉片表型與BTX623一樣，完全無褐紫色壞死斑點以及2個親本。然后提取基因組DNA，構建DNA混池，建庫、測序以及生物信息學分析。對得到的17 847個候選多態性SLAF標簽，通過SNP-index方法進行關聯分析，擬合后的關聯閾值為 0.495 766，共獲得868個與性狀顯著相關的SLAF標記，將該基因關聯到第4條染色體上7.61 Mb的區間上(物理位置為 51 504 457～59 110 341 bp)，關聯區間內的SLAF標記為179個，該區間內預測有885個基因(圖3)。

由于上述分析得到的關聯區域較大，因為該褐紫色壞死斑點葉片控制基因為隱性基因，可將根據具有隱性性狀表型的混池對得到的關聯侯選區域進一步分析，將關聯區域細化，進一步縮小目標基因范圍。選擇SNP-index(aa)>0.9的性狀關聯標記，進一步細化了關聯侯選區域共定位到14個熱點區域，熱點區域大小約為2.88 Mb，關聯到76個分子標記，該區間內預測有317個基因(表2)。

表2 基因關聯熱點區域匯總

3 討論

鉀元素是作物生長所必需的三大元素之一，在植物生長發育中發揮重要作用。作物在缺鉀時，會影響葉綠素合成，嚴重時最終影響產量[17-18]。鉀肥價格相對較高，田間當季利用率不高，培育鉀高效作物，提高作物對鉀肥的吸收、利用效率，是非常重要的途徑[19]，挖掘與鉀吸收利用相關的基因有重要的意義。本研究利用高粱核心種質資源中的1份類缺鉀癥狀種質，其葉尖和邊緣有較多褐紫色壞死斑點，而且呈現老葉癥狀重、新葉輕的特點。對不同位置的葉片進行了礦質元素含量的分析，發現2個元素在老葉與新葉中的積累模式與BTX623不同。對該種質葉片類缺鉀表型進行了遺傳分析和定位，將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區間內。

現在鉀養分相關分子途徑研究結果，一般來自人工誘變突變體或是來自正向遺傳學研究，鮮有來源于自然種質研究[20]。本研究中的類缺鉀癥狀種質8-10，從不同位置葉片離子含量測定的結果來看，8-10中倒3葉中鉀離子含量最低，較倒2葉降低了25.3%(圖2)；而且鉀離子在不同位置葉片中的分布與BTX623也不同，在BTX623中這個時期鉀離子在前3個葉片中的含量幾乎無差異，而在8-10中，前2片葉子鉀離子含量也無差異，而倒3葉鉀含量明顯下降；鈣離子和鎂元素的含量在8-10中倒3葉中明顯增加，而前2片葉子中含量幾乎不變。8-10中倒3葉已出現可見的褐紫色壞死斑點，而倒1和倒2葉沒有明顯的斑點(圖1-B)。植物在缺鉀條件下，一般會促進其他陽離子的吸收，如鈣、鎂，從而緩解缺鉀的影響[21-22]。本研究中在8-10倒3葉中鉀元素含量較倒2葉明顯下降，與之對應的是鈣和鎂含量的大幅度增加。同樣為可移動元素的大量元素磷元素在此時期8-10種質中的前3片葉片中幾乎無變化，表明植株在這個時期老葉中的可移動元素并未向新葉中轉移，葉片中缺鉀很可能是8-10種質顯示類缺鉀癥狀的直接原因。

從遺傳分析上看，該類缺鉀表型符合2對隱性基因控制的分離比例，但是并不符合2對無互作的基因分離比例，因而該類缺鉀癥狀控制的2對基因間很可能是存在互作關系的，至于互作的方式需要進一步深入精細定位、克隆基因才能闡述清楚。值得注意的是，我們利用BSA-Seq將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區間內，到底控制類缺鉀癥狀的2個基因都在這一區間內，還是一個在第4條染色體上，另一個基因分布在其他染色上暫時無法確定。因為畢竟BSA-Seq高通量測序定位所使用的極端個體，挑選的都是與8-10個葉片表型高度一致的個體，那些表型相對弱的個體暫時并未使用到定位分析中。因此下一步需要精細定位使用不同表型個體將該基因克隆出來。另一方面，由于8-10是來源于自然種質的材料，BTX623只能作為一般參照品種，并不能直接準確進行該類缺鉀癥狀控制基因對其他農藝性狀影響的評估，將來需要構建近等基因系材料，從而進行該基因對其他農藝性狀影響的精確分析。

4 結論

本研究從國際高粱核心種質資源中發現了1份葉尖褐變逐漸壞死的類缺鉀癥狀種質。表型性狀分析發現，該類缺鉀癥狀種質在苗期葉片較其他品種如BTX623并無顯著差異；后期葉尖、葉片邊緣逐漸出現褐紫色壞死斑點，而且老葉癥狀重于新葉；不同位置葉片礦質元素含量分析結果表明，鉀、鎂和鈣這3個礦質元素在新老葉片中的積累模式與BTX623有明顯差異。遺傳分析結果表明，該性狀受2個隱性基因控制。BSA-Seq高通量測序定位，最終將該性狀控制基因定位于第4條染色體上7.61 Mb區間內。該特異種質高粱的研究，為高粱鉀相關分子機制研究提供了重要的基礎數據。