大豆VLN基因家族的全基因組鑒定及組織表達(dá)分析

張中起，梁邦平，王俊濤，高保民，劉 艷，王秋玲

(菏澤市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，山東菏澤 274000)

肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(actin cytoskeleton)在真核生物的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)感知和細(xì)胞免疫等過(guò)程中具有重要的作用，而肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(actin-binding proteins，簡(jiǎn)稱ABPs)直接參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重排調(diào)控[1-8]。絨毛蛋白(villin，VLN)是最重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白之一，參與肌動(dòng)蛋白絲的解聚和組裝，具有成核、成帽和切割等功能[9-11]。明確大豆中VLN家族蛋白的特征特性、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)特征等對(duì)于大豆育種和功能基因組學(xué)的研究具有重要意義。VLN蛋白通常具有6個(gè)凝溶膠蛋白(gelsolin，GEL)結(jié)構(gòu)域[12]和1個(gè)C端可以與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的絨毛蛋白頭部(villin headpiece，VHP)結(jié)構(gòu)域[13]，但也有報(bào)道顯示，棉花GhVLN6和GhVLN13蛋白缺少C端VHP結(jié)構(gòu)域[14]。百合絨毛蛋白P-135-ABP具有G-actin結(jié)合活性，并以Ca2+敏感的方式加速肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚[15]。擬南芥VLN基因家族共有5個(gè)成員，所有VLN基因在不同組織中均有表達(dá)，但它們的功能有所差異[13]。擬南芥AtVLN1以不依賴Ca2+的方式結(jié)合和捆綁F-肌動(dòng)蛋白，沒有成核、成帽和切割活性，但它可以穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲免受肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，簡(jiǎn)稱ADF)介導(dǎo)的解聚[16]。轉(zhuǎn)錄因子GLABRA2介導(dǎo)的AtVLN1通路在根毛生長(zhǎng)對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。擬南芥AtVLN2和AtVLN3通過(guò)肌動(dòng)蛋白絲的捆綁成束在厚壁組織發(fā)育中發(fā)揮冗余作用[18]。擬南芥atvln2-atvln3雙突變植株的葉、莖、長(zhǎng)角果和根發(fā)生扭曲，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的顯微鏡分析結(jié)果表明，細(xì)肌動(dòng)蛋白絲束更豐富，而粗肌動(dòng)蛋白絲束幾乎不存在[19]。擬南芥AtVLN3是一種依賴Ca2+調(diào)節(jié)的絨毛蛋白，能夠在AtVLN1存在的情況下切斷肌動(dòng)蛋白絲并促進(jìn)捆綁周轉(zhuǎn)[20]。擬南芥AtVLN4通過(guò)以Ca2+依賴性方式調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白參與根毛生長(zhǎng)[21]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析顯示隨著擬南芥花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)AtVLNs基因表達(dá)葉發(fā)生著變化[22-23]。擬南芥AtVLN5是肌動(dòng)蛋白絲穩(wěn)定性和周轉(zhuǎn)的主要調(diào)節(jié)因子，在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)中起著不可或缺的作用[24-25]。OsVLN2通過(guò)影響水稻微絲動(dòng)力學(xué)和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸調(diào)節(jié)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)[26-27]。GhVLN4通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白組織參與細(xì)胞伸長(zhǎng)[28]，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術(shù)沉默GhVLN4棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性降低，而過(guò)表達(dá)GhVLN4擬南芥對(duì)大麗輪枝菌、鹽脅迫和干旱的抗性提高[29]。目前，對(duì)于植物VLN基因家族及其成員的研究主要集中在擬南芥、水稻等植物中，而大豆VLN基因家族及其成員功能的研究鮮有報(bào)道。本研究以國(guó)產(chǎn)大豆中黃13黃金版參考基因組為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)大豆VLN基因家族的序列特征特性、系統(tǒng)進(jìn)化、表達(dá)模式等進(jìn)行詳細(xì)的分析，初步探究大豆VLNs基因的功能，旨在為深入研究大豆VLN基因家族及其成員基因功能提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 大豆VLN基因家族成員鑒定

國(guó)產(chǎn)大豆中黃13的高質(zhì)量黃金版參考基因組Gmax_ZH13_v2.0序列和注釋文件[30-31]下載于在線數(shù)據(jù)庫(kù)SoyBase[32-33](https：//soybase.org/)；植物VLN蛋白的GEL結(jié)構(gòu)域和VHP結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件PF00626和PF02209下載自在線數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam[34-35](https：//pfam.xfam.org/)；利用隱馬爾可夫模型(HMM)[36]軟件包以PF00626和PF02209為探針?biāo)阉鞔蠖够蚪M，獲得候選VLNs蛋白；利用在線網(wǎng)站NCBI-CDD[37-38](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和SMART[39-40](http：//smart.embl-heidelberg.de/)鑒定候選的大豆VLNs蛋白，保留同時(shí)含有6個(gè)GEL結(jié)構(gòu)域和VHP結(jié)構(gòu)域的蛋白，最終確定為大豆VLNs蛋白。

1.2 大豆VLN家族蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用在線網(wǎng)站PDB[41](https：//www.rcsb.org/)分析大豆VLNs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線網(wǎng)站ExPASy[42](https：//web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算大豆VLNs蛋白的序列長(zhǎng)度、分子量和理論等電點(diǎn)；利用在線網(wǎng)站Plant-mPLoc 2.0[43](http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測(cè)大豆VLNs蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.3 大豆VLN基因家族序列特征分析

利用在線網(wǎng)站MG2C[44](http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制大豆VLNs基因的染色體定位圖；利用在線網(wǎng)站GSDS 2.0[45](http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析大豆VLNs基因的基因結(jié)構(gòu)；利用在線網(wǎng)站MEME[46](http：//meme-suite.org/tools/meme)分析大豆VLNs蛋白的保守基序；利用在線網(wǎng)站PlantCARE[47](http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html)分析大豆VLNs基因上游1 500 bp的啟動(dòng)子序列。

1.4 大豆VLNs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 11[48]軟件構(gòu)建大豆、擬南芥、棉花和水稻4個(gè)物種的VLNs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用TBtools軟件包的One Step MCScanX程序[49]分析大豆及大豆與棉花、擬南芥和水稻VLNs基因的共線性。

1.5 大豆VLNs基因的表達(dá)模式和互作網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)GSA數(shù)據(jù)庫(kù)[50](https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa/)下載并分析中黃13的27個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(GSA編號(hào)：CRA001810，項(xiàng)目編號(hào)：PRJCA000902)及基因表達(dá)數(shù)據(jù)；利用TBtools軟件包的HeatMap程序[49]繪制大豆VLNs基因的組織表達(dá)熱圖；利用在線網(wǎng)站STRING 11.5(https：//cn.string-db.org/)分析大豆VLNs蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆VLN家族的鑒定和結(jié)構(gòu)域分析

本研究從大豆基因組中共鑒定到8個(gè)VLN基因(圖1、表1)，根據(jù)大豆VLNs基因的基因編號(hào)將其按順序編號(hào)為GmVLN1～GmVLN8。蛋白結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖1)表明，每個(gè)VLN蛋白均含有6個(gè)保守的GEL結(jié)構(gòu)域和1個(gè)VHP結(jié)構(gòu)域；大豆VLNs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和β折疊構(gòu)成，α螺旋數(shù)量較β折疊多。

2.2 大豆VLN家族蛋白理化性質(zhì)

由表1可知，大豆VLN家族蛋白長(zhǎng)度介于 885～984個(gè)氨基酸之間，平均為954個(gè)氨基酸；理論等電點(diǎn)介于5.52～5.94之間，平均為5.68；蛋白質(zhì)分子量最大為108.56 ku，最小為99.41 ku，平均為106.09 ku；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果均定位于細(xì)胞質(zhì)。

表1 大豆VLN家族蛋白理化性質(zhì)

2.3 大豆VLN基因家族染色體定位

大豆VLN基因家族定位于8條染色體(圖2)，GmVLN1～GmVLN8分別定位于2號(hào)、3號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、15號(hào)、18號(hào)和19號(hào)染色體，其中GmVLN1、GmVLN2、GmVLN3和GmVLN8分布在染色體的短臂端，GmVLN4、GmVLN5、GmVLN6和GmVLN7分布在染色體的長(zhǎng)臂端。

2.4 大豆VLN基因家族基因結(jié)構(gòu)

大豆VLN基因家族具有相對(duì)保守的基因結(jié)構(gòu)，由圖3可知，大豆VLNs基因的基因組序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，最短的在13 000 bp以上，最長(zhǎng)近21 000 bp，外顯子和內(nèi)含子數(shù)量較多，外顯子數(shù)量平均20多個(gè)；除GmVLN4外，進(jìn)化樹中聚類在同一組的VLNs基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)特征。

2.5 大豆VLN家族保守基序

通過(guò)在線網(wǎng)站MEME分析大豆VLN家族蛋白的保守基序，分析結(jié)果見圖4，大豆VLN家族蛋白共包含10個(gè)特異性的保守基序，除保守基序9的氨基酸長(zhǎng)度較短外，其他9個(gè)保守基序的氨基酸長(zhǎng)度相對(duì)接近；處于進(jìn)化樹末端分枝的VLNs蛋白具有類似的保守基序分布特征，其中基序9、基序10的分布位置較為緊湊，基序3、基序5的分布位置較為緊湊，而基序6分布在蛋白的末端。

2.6 大豆VLN基因家族啟動(dòng)子元件

由大豆VLN基因家族的基因啟動(dòng)子區(qū)順勢(shì)調(diào)控的元件數(shù)量分布見圖5，大豆VLNs基因的啟動(dòng)區(qū)主要含有基因轉(zhuǎn)錄必須的CAAT-box和TATA-box元件、光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件和生物脅迫響應(yīng)元件。其中GmVLN4具有最多的光響應(yīng)元件，有14個(gè)，GmVLN7具有最多的赤霉素響應(yīng)元件，具有茉莉酸響應(yīng)元件和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件的VLNs基因較少，除GmVLN2以外均具有水楊酸響應(yīng)元件，GmVLN4具有最多的脫落酸響應(yīng)元件，僅3個(gè)大豆VLNs基因具有乙烯響應(yīng)元件；6個(gè)大豆VLNs基因具有創(chuàng)傷響應(yīng)元件；大豆VLNs具有數(shù)量較多的干旱脅迫響應(yīng)元件，低溫脅迫響應(yīng)元件和高溫脅迫響應(yīng)元件數(shù)量相對(duì)較少；除GmVLN1和GmVLN5以外均具有生物脅迫響應(yīng)元件。

2.7 大豆、擬南芥、棉花和水稻VLN家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

由大豆、擬南芥、棉花和水稻VLN家族蛋白構(gòu)成的系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類結(jié)果見圖6，可將4個(gè)物種的VLN家族蛋白分為3個(gè)組，每組均含有4個(gè)物種的VLNs蛋白；第Ⅰ組包含的VLNs蛋白數(shù)量最少，為6個(gè)，其中有大豆GmVLN3和GmVLN7；第Ⅱ組包含11個(gè)VLNs蛋白，其中棉花VLNs蛋白數(shù)量最多，為4個(gè)，大豆VLNs蛋白2個(gè)，分別為GmVLN4和GmVLN6；第Ⅲ組包含的VLNs蛋白數(shù)量最多，為15個(gè)，其中棉花VLNs蛋白數(shù)量最多，為8個(gè)，大豆VLNs蛋白4個(gè)，分別為GmVLN1、GmVLN2、GmVLN5、GmVLN8。大豆VLNs蛋白分布在進(jìn)化樹末端相鄰的分枝，遺傳距離上大豆VLNs蛋白與棉花VLNs蛋白最近，與擬南芥次之，與水稻稍遠(yuǎn)。

2.8 大豆VLN基因家族復(fù)制事件和共線性

對(duì)大豆、棉花和擬南芥的VLNs基因進(jìn)行基因復(fù)制和共線性關(guān)系聯(lián)合分析，由表2、圖7-B可知，大豆VLN基因家族間共有4對(duì)旁系同源基因?qū)Γ℅mVLN1-GmVLN2、GmVLN1-GmVLN5、GmVLN2-GmVLN5和GmVLN3-GmVLN7；由表2、圖7-C可知，大豆與陸地棉VLN基因家族間共有9對(duì)直系同源基因?qū)Γ蠖古c擬南芥VLN基因家族間共有8對(duì)直系同源基因?qū)Γ蠖古c水稻VLN基因家族間未鑒定到直系同源基因?qū)Α?/p>

大豆VLNs旁系同源基因?qū)Φ姆峭x替換率(non-synonymous substitution，簡(jiǎn)稱Ka)與同義替換率(synonymous substitution，簡(jiǎn)稱Ks)的比值見表2，大豆VLNs基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了不同的選擇壓力水平；大豆4對(duì)VLNs旁系同源基因?qū)Φ腒a/Ks介于0.21～0.28之間，均小于1，蛋白序列相似度介于88%～97%之間，表明大豆VLNs基因主要受到純化選擇壓力，基因家族成員數(shù)量主要以片段復(fù)制的形式擴(kuò)張，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制事件的發(fā)生。

2.9 大豆VLN基因家族組織表達(dá)模式

為初步探究大豆VLN基因家族的功能，利用大豆品種中黃13在不同生育期的27個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析了VLN基因家族的組織表達(dá)特征。由圖8可知，大豆VLNs基因具有組織表達(dá)和時(shí)空表達(dá)特異性，依據(jù)表達(dá)特征將大豆VLN基因家族分為2組：第1組包含GmVLN2、GmVLN7和GmVLN8，該組基因表達(dá)量相對(duì)較低，在27個(gè)組織中未出現(xiàn)突出的組織優(yōu)勢(shì)表達(dá)特征。第2組包含GmVLN1、GmVLN3、GmVLN4、GmVLN5和GmVLN6，其中在根和莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因有GmVLN3、GmVLN5和GmVLN6；在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因有GmVLN1和GmVLN5；在莢皮和豆莢中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因較多，主要有GmVLN1、GmVLN3、GmVLN4、GmVLN5和GmVLN6。大豆VLN基因家族多樣化和特異性的組織表達(dá)特征暗示著其功能的潛在多樣性和復(fù)雜性。

2.10 大豆VLNs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用STRING網(wǎng)站預(yù)測(cè)并構(gòu)建了大豆VLNs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，由圖9可知，大豆VLNs蛋白間存在互作關(guān)系，其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，簡(jiǎn)稱PI3K)LOC547983處于蛋白互作的核心位置，與膜增殖有關(guān)；Obg-like ATPase 1在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中葉具有一定的協(xié)調(diào)作用；GmVLN4和GmVLN8相互作用處于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的獨(dú)立區(qū)域，由包含HP結(jié)構(gòu)域的蛋白作為中間媒介與其他大豆VLNs蛋白建立互作聯(lián)系。

3 討論

VLN基因在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥、棉花和百合等作物中，VLN基因的功能大多與生長(zhǎng)發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫有關(guān)。關(guān)于VLN基因家族在大豆中的研究并不多。本研究首次從大豆全基因組水平鑒定到8個(gè)VLN家族基因，屬于擬南芥和水稻的5個(gè)VLNs基因[13，27]，而少于棉花的14個(gè)VLNs基因[14]，VLN家族基因數(shù)量的差異可能與物種基因組大小和基因組復(fù)制有一定的關(guān)系。

通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析了大豆VLNs基因的特征特性，根據(jù)8個(gè)GmVLNs基因染色體上的分布將其命名為GmVLN1～GmVLN8。大豆VLNs蛋白均具有8個(gè)GEL結(jié)構(gòu)域和1個(gè)VHP基因結(jié)構(gòu)，分子量和理論等電點(diǎn)有一定的差異，但亞細(xì)胞定位均在細(xì)胞質(zhì)，這一預(yù)測(cè)結(jié)果與棉花GhVLN4定位于細(xì)胞質(zhì)(細(xì)胞骨架)相符合[28]，說(shuō)明大豆VLNs蛋白可能也與細(xì)胞骨架構(gòu)建有一定的關(guān)系。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，大豆VLN家族基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量較多，平均有20個(gè)，且基因序列較長(zhǎng)，這一特征與前人有關(guān)擬南芥、水稻和棉花VLN家族的基因結(jié)構(gòu)研究結(jié)果相符合，表明VLNs基因在物種間具有一定的保守性。大豆VLN家族蛋白均含有10個(gè)相同的保守基序，表明家族成員間具有一定的結(jié)構(gòu)相似性。大豆VLN家族基因啟動(dòng)子元件分析結(jié)果表明，除含有與基因轉(zhuǎn)錄必須的CAAT-box和TATA-box元件以及生長(zhǎng)發(fā)育必須的光響應(yīng)元件以外，不同家族成員還含有大量的植物激素響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件和生物脅迫響應(yīng)元件，其中VLNs基因具有較多數(shù)量的赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件，但茉莉酸響應(yīng)元件、乙烯響應(yīng)元件和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件的數(shù)量較少；此外大豆VLNs基因具有數(shù)量較多的傷害響應(yīng)元件和干旱脅迫響應(yīng)元件，但低溫脅迫響應(yīng)元件和熱脅迫響應(yīng)元件數(shù)量相對(duì)較少。

由系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果可知，大豆VLN家族蛋白分為3個(gè)組，成員間分布在進(jìn)化樹末端相鄰的分枝，遺傳距離上與棉花VLNs蛋白最近，與擬南芥次之，與水稻最遠(yuǎn)。基因復(fù)制和共線性分析結(jié)果表明，大豆VLN基因家族間共有4對(duì)旁系同源基因?qū)Γ蠖古c陸地棉和擬南芥VLN基因家族間均有直系同源基因?qū)Γ蠖古c水稻VLN基因家族間沒有鑒定到直系同源基因?qū)Γ治鼋Y(jié)果也與物種進(jìn)化樹和VLN家族蛋白進(jìn)化樹的結(jié)果相呼應(yīng)。大豆4對(duì)VLNs旁系同源基因?qū)Φ腒a/Ks計(jì)算結(jié)果表明，大豆VLNs基因主要受到純化選擇壓力，基因家族成員數(shù)量主要以片段復(fù)制的形式擴(kuò)張，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制事件的發(fā)生。

本研究對(duì)大豆VLN家族基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行了詳細(xì)分析，初步探究了大豆VLNs基因可能參與生長(zhǎng)發(fā)育的功能。依據(jù)表達(dá)特征將大豆VLN基因家族分為2組，其中在根、莖、花、莢和種子中均發(fā)現(xiàn)了特異性表達(dá)的GmVLNs基因，表明大豆VLN家族基因在功能具有多樣性和復(fù)雜性。大豆VLN家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明成員間可能存在互作關(guān)系，其中磷脂酰肌醇3-激酶處于蛋白互作的核心位置連接著大多數(shù)的VLN蛋白。

4 結(jié)論

本研究從大豆中共鑒定到8個(gè)VLNs基因，分別定位于8條染色體，并將其命名為GmVLN1～GmVLN8。大豆VLN家族蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)有一定的差異但亞細(xì)胞定位均在細(xì)胞質(zhì)。大豆VLN家族基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量較多，啟動(dòng)子區(qū)具有數(shù)量較多的CAAT-box和TATA-box元件以及生長(zhǎng)發(fā)育必須的光響應(yīng)元件，此外部分VLNs基因還含有大量的植物激素響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件和生物脅迫響應(yīng)元件。大豆VLN基因家族間共有4對(duì)旁系同源基因?qū)Γ饕艿郊兓x擇壓力，與棉花VLNs蛋白遺傳距離上較近。部分大豆VLNs基因在根、莖、花、莢和種子中特異性表達(dá)。大豆VLN家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明成員間可能存在互作關(guān)系。本研究為深入表征大豆VLN基因家族成員的功能以及表達(dá)互作調(diào)控機(jī)制提供了重要理論數(shù)據(jù)。