煙草黑脛病生防功能菌篩選及其應用效果

郝浩浩 李 翔 郭傳濱 吳俊林 唐培培 趙佳佳 孫會忠

（1河南省煙草公司駐馬店市公司，河南駐馬店 463000；2河南科技大學農(nóng)學院，河南洛陽 471000）

絡石（T.jasminoides）屬夾竹桃科絡石屬，是一種傳統(tǒng)中草藥植物，有抑菌、抗痛風之效，臨床多用于治療坐骨神經(jīng)、關節(jié)炎、喉痹咽塞、喘息不通、咳嗽喘息、腹瀉等癥[1]。除具有藥理作用外，絡石也是常見的園林觀賞植物。很多藥用植物因受到其生長環(huán)境的地域差異和自身發(fā)育生物學等因素的影響，人們對其研究和開發(fā)利用不夠深入[2]。從植物內(nèi)生細菌微生物資源中尋找功能菌已成為生物資源開發(fā)的熱點方向。一些從藥用植物中分離出的特定內(nèi)生菌在與宿主植物長期協(xié)同進化的過程中，往往能產(chǎn)生與其相同或相似的生物活性物質(zhì)，從而表現(xiàn)出特定的功能活性，這是植物內(nèi)生菌資源包括生防菌開發(fā)研究的理論依據(jù)之一[3]。許多藥用植物的內(nèi)生菌不但能促進植物自身的生長發(fā)育，內(nèi)生菌抑菌活性也可廣泛應用于中藥植物栽培中的生物防治[4-5]。另外，一些藥用植物中分離出的內(nèi)生細菌產(chǎn)生的活性成分對腫瘤細胞的生長也有抑制作用，表現(xiàn)出抗腫瘤作用[6-8]。因此，從傳統(tǒng)中藥植物中分離篩選特色功能菌資源具有重要的現(xiàn)實意義。

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，全國各植煙區(qū)均有發(fā)生，對煙草生產(chǎn)造成了很大的損失。煙草綠色生產(chǎn)的客觀需求，使得生物防治成為普遍重視的研究熱點之一[9]。為此，本研究以野生絡石為試驗材料，對內(nèi)生細菌進行分離培養(yǎng)，篩選鑒定具有顯著抑菌活性的微生物資源，并通過盆栽試驗驗證內(nèi)生細菌的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年7月，筆者于洛陽市天池山采集野生絡石完整植株作為試驗材料。指示病原真菌：煙草黑脛病原（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）由洛陽農(nóng)林科學院劉順通研究員惠贈。

1.2 培養(yǎng)基

NA固體培養(yǎng)基：內(nèi)生細菌的分離和培養(yǎng)及拮抗試驗用。PDA培養(yǎng)基：病原真菌的培養(yǎng)及拮抗試驗用。LB液體培養(yǎng)基：生防菌菌懸液制備用。所有培養(yǎng)基在120℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min備用。

1.3 內(nèi)生細菌的分離和純化

將絡石流水沖洗20 min后，用75%乙醇浸泡2 min，無菌水漂洗3次，再用0.1%升汞二次浸泡消毒2 min，無菌水漂洗3次（取最后1次無菌水漂洗液涂板，無菌生長作為是否消毒徹底的依據(jù)）。將消毒后的植株放入無菌研缽中5 mL無菌水研磨成漿，靜置5 min，用移液槍吸取60μL上清液，涂布NA平板中，28℃培養(yǎng)2～3 d。挑取典型菌落進行劃線純化。

1.4 內(nèi)生菌抑菌活性篩選

1.4.1菌懸液的制備。將純化的內(nèi)生細菌接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。取適量菌液于滅菌離心管中，12 000 r/min離心15 min，收集菌體，用無菌水懸浮并調(diào)整濃度至1.0×108CFU/mL，獲得菌株菌懸液[10]。

1.4.2 平板對峙實驗。采用牛津杯平板對峙法[11]，分別考察分離內(nèi)生細菌對指示病原真菌黑曲霉的拮抗作用。在PDA平板中央接入黑曲霉菌餅，距菌餅3 cm處左右對稱放置2個牛津杯，且每個牛津杯加注20μL制備好的內(nèi)生細菌菌懸液，以牛津杯注入無菌水為作為對照，做3次重復，然后置于28℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5～7 d，定期觀察生長情況。

1.5 菌株的多相分類鑒定

1.5.1 形態(tài)學觀察及生理生化特征測定。將測定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，制樣進行光鏡和掃描電鏡下的形態(tài)觀察[12]。生理生化指標的測定方法參考文獻[13-14]，測定方法參考文獻進行。

1.5.2 菌株16S rDNA分析。將測定菌株接種于LB固體培養(yǎng)基過夜搖床培養(yǎng)，采用試劑盒提取基因組DNA；選用通用引物：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR體系及操作方法參考文獻進行。測序結果提交NCBI進行比對，并采用MEGA7的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.6 目標菌抑菌作用應用試測實驗

測試植株的制備：用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草黑脛病病原，并制備孢子懸液（血球計數(shù)板檢測孢子數(shù)目，調(diào)整孢子濃度至1.0×105CFU/L）。侵染方法：取1 mL孢子懸浮液于接種到植株根部，以無菌水處理為對照。26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光周期12 h黑暗交替。

將測試菌株用LB液體培養(yǎng)基32℃搖床培養(yǎng)至OD=4，然后12 000 r/min離心15 min收集菌體，再用等量無菌水懸浮菌體制得測試母液。施用方法：噴霧法（葉片完全濕潤為標準）和灌根法（土表沿莖基部澆注5 mL）。施用時間：病原侵染2 d后。每處理3次重復，以無菌水處理作為對照，7 d后進行葉片病情指數(shù)及發(fā)病率的調(diào)查。

1.7 統(tǒng)計分析

煙草黑脛病調(diào)查分級標準：0級，全株無病；1級，莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數(shù)以下葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；2級，莖部病斑超過莖圍的1/2，或半數(shù)以上葉片凋萎；3級，莖部病斑環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎；4級，病株全部葉片凋萎或枯死。

病情指數(shù)＝（∑各級病株或葉數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株或葉數(shù)×最高級值）×100；

防治效果（%）＝（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100

2 結果與分析

2.1 絡石內(nèi)生細菌分離結果

絡石營養(yǎng)體混合樣研磨涂布NA平板中，28℃培養(yǎng)2～3 d以后，平板上形成特征典型的菌落（圖1）。挑取菌落進行3次劃線純化，共獲得31株細菌活體純培養(yǎng)物，依次編號為HHH12～HHH31。15%甘油于-20℃保種備用。

圖1 絡石內(nèi)生菌分離平板生長情況

2.2 絡石內(nèi)生細菌生防活性菌株篩選結果

以煙草黑脛病原為指示菌，分別對獲得的31株絡石內(nèi)生細菌的拮抗活性進行考察。對峙試驗結果表明，HHH12菌株對煙草黑脛病；病原菌絲具有明顯的抑制作用（圖2），抑菌圈直徑達到24 mm，初步將其定性為具有生防活性功能菌株。

圖2 菌株形成的抑菌圈

2.3 菌株HHH12的分類鑒定結果

將菌株HHH12在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察可見，菌落呈黃色，不透明，邊緣整齊，隆起明顯，表面濕潤（圖3-A）。革蘭氏染色陰性，菌體呈直桿形，多單生，兩端鈍圓，具端鞭毛，長介于2.3～3.6μm，直徑介于1.1～1.5μm（圖3-A，B）。

圖3 菌株HHH12的形態(tài)特征

菌株HHH12的生理生化指標測定結果：測定結果呈陽性反應的項目包括明膠水解試驗試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、接觸酶試驗、脲酶水解試驗和吲哚試驗；陰性反應項目包括淀粉水解、甲基紅試驗、糖類發(fā)酵試驗。

菌株HHH12的16S rDNA序列分析結果：菌株HHH12的16S rDNA基因擴增產(chǎn)物測序結果為1 503 bp，序列提交GenBank獲得登錄號OL966065。在GenBank比對獲得同源性較高序列并構建進化樹（圖4）。結果表明，菌株HHH12與Pseudomonas fluorescens（LS483372.1）、P.fluorescens（MT712234.1）和P.fluorescens（NR114476.1）聚為一支，相似度達到98%。結合菌株LZ-7的形態(tài)、生理生化和分子鑒定結果，將其鑒定為假單孢菌屬菌株，暫命名為Pseudomonassp.HHH12。

圖4 菌株HHH12的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株HHH12的生防應用效果

通過盆栽試驗，考察菌株HHH12對煙草黑斑病的生物防治效果，試驗結果見表1。由表1可知，HHH12菌懸液的灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種處理表現(xiàn)出不同的生防效果，整體而言，灌根+葉面噴霧混合處理在不同發(fā)病階段均表現(xiàn)出比葉面噴霧和灌根單一處理有更好的應用效果，施藥后14 d時的防治效果達到72.86%，是灌根處理的1.09倍，是葉面噴霧處理的2.94倍。葉面噴霧和灌根相比較而言，后者優(yōu)于前者，14 d時的灌根處理的防治效果是葉面噴霧的2.71倍。3種施用方法的防治效果相互之間差異達顯著水平。驗證結果進一步證實，HHH12菌株對煙草黑脛病的防治是有效的。可見，單一灌根和灌根+葉面噴霧均具有較好的生防效果，單一葉面噴霧效果較差，不建議使用。

表1 菌株HHH12對花葉絡石葉斑病的防治效果（平均值±標準誤）

3 討論與結論

植物內(nèi)生菌是篩選功能微生物的一個重要來源。本研究采用NA培養(yǎng)基從野生絡石營養(yǎng)體中分離得到31株內(nèi)生細菌活體純培養(yǎng)物，說明野生絡石植株體內(nèi)生細菌資源多樣性豐富。如果不斷優(yōu)化和改變分離培養(yǎng)基類型，分離到更多種類的內(nèi)生菌是可能的。

絡石作為一種傳統(tǒng)中草藥植物，其核心功效是抑菌、抗痛。依據(jù)自然界生物的協(xié)同進化原理和規(guī)律[16]，從絡石營養(yǎng)體內(nèi)篩選出具有抑菌作用的生防菌也是可能的。本研究開展的31株菌株對煙草黑脛病原的對峙試驗證實了這一推測，其中菌株HHH12的平板對峙抑菌圈直徑達到24 mm，符合生防菌初篩判斷規(guī)律[4-5，18]。該菌株具有進一步開發(fā)應用的前景。

在對菌株HHH12的多相鑒定中，菌株的形態(tài)特征和測定的生理生化特征指標與文獻報道的假單孢菌屬特征描述基本吻合[13，17-18]，但16S rDNA序列構建的系統(tǒng)進化樹顯示的菌株HHH12與同源菌種16S rDNA序列的相似度僅為96%，未達到鑒定到同種序列相似度大于98%的一般要求，故將菌株HHH12歸屬于假單孢菌屬，暫命名為Pseudomonassp.HHH12。

本研究通過盆栽試驗進一步證實了菌株HHH12的生防活性，在灌根、葉面噴霧和灌根+葉面噴霧3種不同處理中，灌根+葉面噴霧的效果最好，單一灌根也取得了67.15%的防治效果。可見，灌根處理配合葉面噴霧具有一定的增效作用，這可能與菌株HHH12的內(nèi)生特性有關，但不同功能微生物的發(fā)揮作用機制是極為復雜的，有待后續(xù)不斷深入研究。