浸潤性乳腺癌患者組織P120ctn p53及CK5/6表達及意義分析

林偉強， 袁惠玲， 溫潤耀， 葉建森， 張愛玲

(南方醫科大學附屬東莞醫院/東莞市人民醫院乳腺科， 廣東 東莞 523000)

乳腺癌是女性高發惡性腫瘤，其中以浸潤性乳腺癌(invasive breast carcinoma,IBC)多見，因IBC容易出現局部復發、轉移，有關其研究備受重視[1]。P120連環蛋白(catenin,P120ctn)為連環蛋白家族成員之一，可參與細胞信號傳導、黏附作用等過程，其異常表達與惡性腫瘤侵襲、轉移有關[2]。p53基因是人體重要的抑癌基因，正常情況下其編碼的野生型p53蛋白可通過誘導凋亡、幫助基因修復參與腫瘤抑制過程，但突變型p53蛋白則喪失誘導細胞凋亡能力，與細胞惡性轉化有關，因此p53蛋白在惡性腫瘤診斷、預后評估中有一定應用[3]。細胞角蛋白5/6(Cytokeratin5/6,CK5/6)是一種基底細胞角蛋白，與上皮細胞的增殖分化關聯密切，在維持上皮組織連續性、完整性中起重要作用[4]。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NAC)在惡性腫瘤治療中十分普遍，其主要目的在于縮小腫瘤病灶、殺滅轉移癌細胞，從而為后期局部手術或放療奠定良好基礎，早期預測NAC療效可為臨床診療方案制定提供參考[5]。為此，本研究采用免疫組化法分析了IBC患者癌組織P120ctn、p53、CK5/6表達情況，旨在探究其與臨床病理特征、NAC療效關系，從而為后期IBC患者預后評估及診療方案制定提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料：回顧性分析2018年10月至2021年10月120例女性IBC患者臨床資料。納入標準：①均經穿刺活檢或術后病理明確IBC診斷，即顯微鏡下見癌細胞侵入乳腺導管、基底膜和間質的乳腺癌類型；②入院前無任何抗乳腺癌治療；③適合行NAC者，即臨床分期ⅡA、ⅡB、ⅢA(僅T3、N1、M0)希望縮小腫塊、降期保乳者，或臨床分期ⅢA(不含T3、N1、M0)、ⅢB、ⅢC期者，且術前均接受規范NAC；④留存足夠行免疫組化分析[一般厚度0.3cm、面積(1.0～1.5)cm×(1.0～1.5)cm]的癌組織、癌周組織標本；⑤臨床病理資料完善。排除標準：①腫瘤復發者或其他部位惡性腫瘤轉移者；②入組時已發生遠處轉移者；③合并免疫疾病、血液病、內分泌疾病、急慢性感染等其他嚴重疾病者；④未按規定完成NAC治療者；⑤特殊類型乳腺癌或男性乳腺癌患者。120例患者年齡28～79歲，平均(55.74±11.35)歲；乳腺癌分子分型Luminal A型[雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptormPR)陽性，人類表皮生長因子受體-2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)陰性，腫瘤增殖抗原Ki-67<14%]27例，Luminal B型(ER陽性和/或PR陽性，HER2陰性、Ki67≥14%；或ER陽性和/或PR陽性，HER2陽性，無論Ki67表達如何)62例，HER-2過表達型(ER陰性、PR陰性、HER2陽性)19例，三陰性(ER陰性、PR陰性、HER2陰性)乳腺癌12例；臨床分期：Ⅱ期56例，Ⅲ期64例。

1.2方 法

1.2.1臨床資料收集：收集患者臨床病理資料，包括年齡、是否絕經、腫瘤直徑、分子分型、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期等。

1.2.2免疫組化

1.2.2.1主要試劑和儀器：P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人單克隆抗體及二抗試劑盒均購自上海信裕生物科技有限公司；EDTA抗原修復液、DAB顯色劑購自北京百奧萊博科技有限公司；MY2300型全自動免疫組化染色機購自上海精密儀器儀表有限公司，Olympus BX53光學顯微鏡購自上海普赫光電科技有限公司。

1.2.2.2免疫組化檢測：組織標本均經4%中性甲醛固定，常規制作4μm厚石蠟切片，免疫組化染色采用EnVision二步法，主要步驟：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，EDTA法高溫高壓抗原修復，3%H2O2行過氧化氫酶阻斷，1%BSA封閉非特異性抗原，滴加一抗(P120ctn、p53、CK5/6鼠抗人單克隆抗體，4℃孵育過夜)，滴加二抗(常溫孵育1h)，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片；切片均設陽性(已知陽性標本)和陰性對照(PBS緩沖液代替一抗)。

1.2.2.3結果判定：先于低倍鏡下觀察染色，找到合適視野后，隨機選取5個視野(≥100個細胞)，p53、CK5/6于400倍鏡下觀察染色強度和陽性細胞表達(陽性細胞數/總細胞數×100%)，其中p53以細胞核著色為陽性，CK5/6以細胞膜或細胞質著色為陽性，A染色強度分為不著色(0分)、淺黃色(1分)、棕色或黃色(2分)、深棕色或棕褐色(3分)，B陽性細胞表達可分為<5%(0分)、5～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)；最后積分取5個視野平均值，其中A×B≥2分為陽性表達，否則為陰性表達。P120ctn觀察細胞膜、細胞質染色情況，正常情況下P120ctn定位于細胞膜，著色后呈棕黃色，正常細胞P120ctn膜陽性細胞率>75%，而腫瘤細胞P120ctn膜表達下降、細胞質表達升高，當P120ctn胞質比率>10%時視為陽性表達。結果判斷由2名均有具有中級及以上職稱病理科醫師采用雙盲法進行診斷，結論不一致時協商達成一致。

1.2.3NAC方案及療效評價：參考2019年版《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范》[5]行NAC治療，均采用TAC方案，即多西他賽(75mg/m2，靜滴，d1)+多柔比星(50mg/m2，靜滴，d1)+環磷酰胺(500mg/m2，靜滴，d1)方案，以21d為1個周期，共6個周期，各周期均采用粒細胞集落刺激因子支持。于第2個周期末評估NAC療效，采用磁共振檢查，參考實體瘤療效評價標準1.1版[6]分為完全緩解(complete remission,CR)、部分緩解(partial response,PR)、疾病穩定(stable disease,SD)和疾病進展(progression disease,PD)，統計有效率，即(PR+CR)/總例數×100%。PR患者繼續行2個周期NAC，然后于3周內行手術治療，CR、SD、PD患者改行手術，其中CR、PR者手術后繼續完成原化療方案；SD、PD術后更換其他化療方案。

1.3統計學分析：應用SPSS24.0軟件，用n(%)表示計數資料，比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關法；影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析；P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1癌組織與癌周組織P120ctn、p53及CK5/6陽性表達率比較：癌組織P120ctn、p53及CK5/6陽性表達率均顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌周組織P120ctn p53及CK5/6陽性表達率比較n(%)

2.2癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達與臨床病理特征關系：P120ctn陽性表達率與分子分型、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與年齡、是否絕經、腫瘤直徑、組織學分級、臨床分期無關(P>0.05)；p53與腫瘤直徑、分子分型、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期有關(P<0.05)，與年齡、是否絕經無關(P>0.05)；CK5/6與分子分型、組織學分級有關(P<0.05)，與年齡、是否絕經、腫瘤直徑、淋巴結轉移、臨床分期無關(P>0.05)。見表2。

表2 癌組織P120ctn p53及CK5/6表達與臨床病理特征關系n(%)

2.3癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達相關性：Spearman秩相關分析顯示，癌組織P120ctn與p53、CK5/6表達均呈正相關(r=0.384、0.406)，p53與CK5/6表達呈正相關(r=0.581)，均有統計學意義(P<0.05)。

2.4術前NAC療效：120例患者術前經2個周期NAC后，有27例(22.50%)達CR，49例(40.83%)達PR，34例(28.33%)SD，10例(8.33%)發生PD，有效率為63.33%(76/120)。

2.5影響患者NAC療效的單因素分析：單因素分析顯示，腫瘤直徑>2cm、組織學分級G3、淋巴結轉移、P120ctn陽性表達、p53陽性表達、CK5/6陽性表達者有效率較低(P<0.05)；但患者年齡、是否絕經、分子分型、臨床分期與NAC療效無關(P>0.05)。見表3。

表3 影響患者NAC療效的單因素分析n(%)

2.6影響患者NAC療效的多因素Logistic回歸分析：多因素Logistic回歸分析顯示，淋巴結轉移、P120ctn表達陽性、p53表達陽性是影響患者NAC療效的危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響患者NAC療效的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

P120ctn最早是作為Src激酶底物被發現，其可通過與鈣粘蛋白胞漿近膜端結合成鈣粘蛋白-連環蛋白復合物，從而增強鈣粘蛋白穩定性，參與細胞黏附、侵襲、遷移等行為調節；胞質中P120ctn能通過誘導Ras同源基因家族成員A蛋白活化，增加應力纖維形成，從而促進腫瘤細胞遷移；P120ctn還能與轉錄因子Kaiso相互作用，參與wnt信號通路中某些基因轉錄調控[7]。已有文獻指出[8]，P120ctn對浸潤性導管乳腺癌遠處轉移、定植有很強的促進作用。本文結果顯示，IBC患者癌組織P120ctn陽性表達率明顯升高，且與患者分子分型、淋巴結轉移有關有關，提示P120ctn可參與IBC發生發展過程，與沈倩等[9]報道相似。

p53基因是迄今發現和人惡性腫瘤關聯度最高的基因，其編碼的p53蛋白由393個氨基酸組成，可通過介導轉錄激活參與細胞周期阻滯、促進細胞分化、誘導凋亡過程，發揮抑制腫瘤細胞增殖作用；但p53基因在內外因素刺激下突變頻繁，而突變p53蛋白失去正常野生型p53蛋白功能，反而有損傷正常細胞DNA、促進細胞異常增殖作用。因突變p53蛋白半衰期延遲，可在組織大量積聚，經免疫組化檢測的p53蛋白一般是突變的p53。既往有報道指出[10]，p53在結直腸腺癌癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織。本研究發現，IBC患者癌組織p53陽性表達率明顯高于癌旁組織，且p53與腫瘤直徑、分子分型、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期有關。袁明明等[11]研究認為，p53在浸潤性乳腺癌組織中高表達占比較高，且與患者分子分型、組織學分級有關，支持本研究結果。

細胞角蛋白是主要分布于上皮細胞胞質的骨架蛋白，其與其他胞質內輔助蛋白形成的復雜網絡系統可源于核膜、橫跨胞質至上皮細胞間，因此能維持上皮組織連續性、完整性，其中CK5/6是指分子量為58kDa、56kDa的細胞角蛋白，可于乳腺腺中間細胞、定向肝細胞、肌上皮中間細胞表達，CK5/6異常升高可能提示上皮細胞癌。本文研究顯示，IBC患者癌組織CK5/6陽性表達率升高，且與分子分型、組織學分級有關，提示CK5/6可參與IBC發展。陶玉梅等[12]報道指出，CK5/6在IBC患者癌組織中陽性表達率較高，且以三陰性乳腺癌中表達最高，其表達陽性意味著惡性程度更高、侵襲性更強、預后更差，而且CK5/6還與表皮生長因子受體表達呈正相關，與本研究有相似之處。

NAC在乳腺癌治療中占重要地位，通過NAC不僅可獲得患者藥敏反應信息，為后期治療提供參考，還能對乳腺癌降期，使患者手術治療或保乳手術治療成為可能，因此早期預測NAC療效對臨床診療方案制定十分重要。本文結果顯示，120例患者術前經2個周期NAC后，有效率可達63.33%，其中淋巴結轉移、P120ctn及p53表達陽性是影響患者NAC療效的危險因素，提示P120ctn、p53或許可作為IBC患者NAC的療效預測指標，這可能與P120ctn、p53能介導腫瘤耐藥性有關，值得深入研究。不過本研究并未發現CK5/6對患者NAC療效影響，可能因為CK5/6并非是影響患者化療敏感性的因素，這一結果也可能受研究樣本選擇影響，后期可擴大樣本、進行多中心研究。上述結果提示臨床，通過P120ctn、p53靶向調控或可以抑制乳腺癌侵襲、轉移，改善患者預后，這為后期乳腺癌治療靶點發掘提供了新思路。此外，本研究還發現，癌組織P120ctn、p53及CK5/6表達互呈正相關，提示P120ctn、p53、CK5/6在IBC發生、發展中可能存在一定協同作用。本研究不足之處在于，受隨訪時間限制，未分析P120ctn、p53及CK5/6表達與患者遠期預后關系，后期完善隨訪后可進一步探究。

綜上所述，IBC患者癌組織P120ctn、p53、CK5/6陽性表達率明顯升高，且均與患者臨床病理特征表現出一定相關性，其中P120ctn、p53陽性表達是影響患者NAC療效的危險因素，可能作為IBC患者NAC療效的早期預測指標加以探究。