miR-146a對電點燃癲癇發(fā)作孕鼠子代的腦發(fā)育和認(rèn)知功能影響

米爾古麗·艾麥特， 不艾吉爾·艾力， 王成鳳， 曼古努爾·玉山， 仲 婷， 景 燕， 木克代斯·米爾地洋， 李紅燕

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830001)

癲癇屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中僅次于腦血管病的第二大常見病[1]。妊娠可能增加癲癇發(fā)作頻率，更可能造成胎兒早產(chǎn)、先天畸形、出生體重降低、發(fā)育遲滯、認(rèn)知損傷，甚至極易誘發(fā)兒童癲癇等嚴(yán)重疾患[2]。臨床數(shù)據(jù)[2]顯示，孕期癲癇發(fā)作與抗癲癇藥物都可能會造成子代神經(jīng)功能發(fā)育遲緩，甚至影響到子代成年后的認(rèn)知功能，尤其是對語言能力的形成影響深遠(yuǎn)。因此，通過動物模型更加深入了解該疾病的發(fā)病機制有助于更精確治療策略的實施。然而，孕期癲癇發(fā)作引起子代成年后認(rèn)知功能和海馬結(jié)構(gòu)損傷的實驗研究相對較少，組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變及其發(fā)生機制仍有待進一步深入闡明。miR-146a在癲癇成人和兒童都出現(xiàn)表達(dá)增高，且抑制miR-146a能夠降低癲癇的易感性，減少發(fā)作頻率[3]。但miR-146a對孕期癲癇的作用未見相關(guān)報道。因此，本研究以電點燃癲癇發(fā)作孕鼠為研究對象，從組織學(xué)水平觀察miR-146a對電點燃癲癇發(fā)作孕鼠子代的大腦發(fā)育和認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗動物：18只240～270g SPF級雌性SD大鼠，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號SYXK(新)2018-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±1)℃、相對濕度(60±5)%，12h光照/黑暗周期，自由進食和飲水，飼料為孕鼠專用。

1.1.2主要試劑：miR-146a抑制劑(西安擎科生物有限公司)；尼氏染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)；高爾基染色試劑盒(美國Thermo公司)。

1.1.3儀器：癲癇完全點燃電刺激儀器、生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；Morris水迷宮設(shè)備(江蘇賽昂斯公司，SA201)；熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司，Applied Biosystems 7500)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，BX53)；激光掃描共聚焦顯微鏡(美國Thermo公司，CX7 Pro)。

1.2方 法

1.2.1分組及干預(yù)：18只大鼠隨機數(shù)字法分為對照組、模型組和miR-146a抑制劑組，每組6只。對照組：大鼠只植入電極，不進行電刺激；模型組：大鼠進行電刺激癲癇模型構(gòu)建；對照組與模型組分別靜脈注射PBS溶液，每周2次至大鼠分娩。miR-146a抑制劑組：大鼠癲癇模型構(gòu)建成功后開始注射miR-146a抑制劑(劑量：2mg/kg)，該抑制劑是西安擎科生物有限公司合成，每周2次至大鼠分娩。

1.2.2電極植入：將大鼠麻醉后固定在立體定向儀上，頂部皮膚消毒，切開頭皮，完全暴露顱骨。于大鼠頭骨鉆孔，電極穿透顱骨，插入腦皮質(zhì)。參照Paxinos大鼠腦立體定向解剖圖譜[4]，確定大鼠杏仁基底核坐標(biāo)為：-2.8mm，±4.8mm，-8.5mm，于杏仁基底處分別植入刺激電極、記錄電極并固定。

1.2.3電流刺激點燃癲癇：將大鼠頭部電極與刺激器和腦電記錄儀連接，通電刺激，誘導(dǎo)癲癇。參數(shù)：刺激頻率60Hz，波寬1.0ms，串長10s，恒定單向電流刺激，每天1次。當(dāng)動物連續(xù)7d出現(xiàn)Racine評分4～5級，標(biāo)志癲癇點燃成功。將雌鼠與健康成年雄鼠合籠，陰道涂片監(jiān)測雌鼠受精，精子陽性者定為懷孕第0天(G0)。對照組不進行電刺激，維持模型組與miR-146a抑制劑組點燃狀態(tài)，隔日開展一次電刺激，直至G20天，記錄孕鼠癲癇等級。等待孕鼠自然分娩。最終，各組孕鼠在21～23d自然分娩，對照組雌鼠4只分娩，共39只，模型組雌鼠3只分娩，共25只，miR-146a抑制劑組雌鼠4只分娩，共34只。將各組雌鼠分娩的所有子代分配至對應(yīng)三組。測量仔鼠出生后2、4、7、14d體重、體長，觀察開眼，出牙，睜眼時間，記錄出生后第7、14d翻正反射與抓握反應(yīng)所用時間。

1.2.4Racine行為學(xué)分級法：0級=無任何反應(yīng)；1級=面部陣攣，包括節(jié)律性咀嚼、眨眼、立須、豎尾等；2級=節(jié)律性點頭運動為主的肌肉抽搐；3級=單側(cè)前肢陣攣、抽搐；4級=雙側(cè)前肢陣攣、抽搐且后肢站立；5級=背曲、后肢強直加失衡跌倒。

1.2.5腦電圖(electroencephalogram,EEG)描測：將大鼠頭部電極與刺激器和腦電記錄儀連接，采用頻率60Hz，波寬1.0ms，串長1s的單向方波恒流參數(shù)刺激。電流強度由50μA開始刺激，每次間隔5min遞增20μA，直至EEG可見≥3s的棘波放電，記錄此時的電流強度。在相同電流強度下，通過軟件描記皮層EEG。

1.2.6RT-PCR檢測仔鼠腦組織中miR-146a含量：取出生后1d仔鼠腦組織，每組5只，液氮中磨碎，加入Trizon Reagent震蕩混勻。離心取上清，加入氯仿，劇烈振蕩。離心取上層無色水相至一個新的離心管中，加入無水乙醇混勻，提取分離得到總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA進行qPCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：5μL 2×All-in-One QPCR Mix，0.2μL 2μM正向引物，0.2μL 2μM反向引物，2μL cDNA，補充ddH2O至10μL體系。擴增反應(yīng)條件：95℃ 10min預(yù)變性，95℃ 15s 45循環(huán)變性，60℃ 1min退火。定量分析結(jié)果以Ct值表示，用2-△△Ct方法計算目的基因相對表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列

1.2.7水迷宮檢測仔鼠認(rèn)知功能：取出生后84d仔鼠，正式實驗前開展自由游泳適應(yīng)。定位航行測試共5d，用于評估大鼠學(xué)習(xí)能力。每天分上、下午兩個時間段，每段訓(xùn)練4次。各個象限依次作為入水點，面向池壁輕輕放入水中。記錄大鼠從入水到爬上逃生平臺時間，即逃避潛伏期。空間探索實驗：評估大鼠的空間記憶能力。定位航行實驗完畢次日，撤除平臺，選擇第I象限為入水點，記錄大鼠在120s內(nèi)為搜尋平臺而在平臺象限的游泳時間和穿越平臺象限的次數(shù)。

1.2.8尼氏染色檢測神經(jīng)元損傷：取出生后85d仔鼠全腦組織，固定于10%福爾馬林溶液，常規(guī)脫水包埋。將腦組織切成厚5μm切片，常規(guī)脫蠟至水。切片置于焦油紫染色液中，56℃環(huán)境中浸染1h。蒸餾水沖洗切片，使用Nissol Differentiation試劑分化1～3min，顯微鏡下觀察，當(dāng)背景接近無色停止。梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.9高爾基染色觀察樹突棘狀態(tài)：取出生后85d仔鼠全腦組織，浸泡于溶液1與溶液2的混合液(溶液1、2以及溶液3、4、5均是高爾基染色試劑盒中試劑)中，冷藏14d。轉(zhuǎn)移腦組織至溶液3中冷藏48h，異戊烷冷凍包埋，切成10μm厚切片，載玻片貼片，滴加溶液4與溶液5混合液反應(yīng)30min。蒸餾水沖洗切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹膠封固。激光共聚焦顯微鏡下捕獲海馬區(qū)樹突棘圖像，統(tǒng)計樹突棘密度。

2 結(jié) 果

2.1各組孕鼠分娩的仔鼠觀察：仔鼠體重與體長方面，模型組仔鼠都明顯低于對照組和miR-146a抑制劑組(P<0.001)。仔鼠翻正反射方面，仔鼠出生后的第7d，模型組仔鼠翻正反射所用時間明顯高于對照組和miR-146a抑制劑組(P<0.001)；在第14d，各組仔數(shù)翻正反射所用時間比較快，沒有差異。仔鼠抓握反應(yīng)方面，仔鼠出生后的第7d與第14d，模型組仔鼠抓握反應(yīng)低于對照組(P<0.01)，但miR-146a抑制劑組明顯高于模型組(P<0.001)。見圖1與表2。

圖1 各組仔鼠出生后體重與體長變化注：與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

表2 各組仔鼠出生后的情況變化

2.2各組仔鼠mRNA基因表達(dá)比較：與對照組相比，模型組miR-146a基因表達(dá)量升高P<0.01)。與模型組相比，miR-146a抑制劑組miR-146a基因表達(dá)量降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組仔鼠miR-146a基因表達(dá)量

2.3各組仔鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較：與對照組對比，模型組仔鼠潛伏期增加(P<0.05)；對照組與miR-146a抑制劑組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第3d起，與模型組相比，miR-146a抑制劑組潛伏期明顯減少(P<0.01)。如表5所示，在穿越平臺區(qū)域次數(shù)方面，與對照組相比，模型組仔鼠明顯減少(P<0.05)；在平臺象限游泳時間方面，與對照組相比，模型組仔鼠也明顯縮短(P<0.001)；與模型組相比，miR-146a抑制劑組穿越平臺次數(shù)與平臺象限游泳時間明顯增加(P<0.05)。見表4、表5。

表4 水迷宮實驗逃避潛伏期(s)

表5 水迷宮空間探索實驗

2.4尼氏染色觀察各組仔鼠腦組織神經(jīng)元：在仔鼠顳葉皮層和海馬下托復(fù)合體中，與對照組相比，模型組和miR-146a抑制劑組中尼氏體數(shù)量減少；與模型組相比，miR-146a抑制劑組中數(shù)量增加。見圖2。

圖2 仔鼠顳葉皮層和海馬下托復(fù)合體尼氏染色結(jié)果(n=5，×200倍)

2.5高爾基染色觀察各組仔鼠海馬區(qū)樹突棘：與對照組相比，模型組樹突棘長度和數(shù)量明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，miR-146a抑制劑組中樹突棘長度和數(shù)量增加(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 仔鼠海馬區(qū)樹突棘高爾基染色結(jié)果(×100倍，×1000倍)

圖4 仔鼠海馬區(qū)樹突棘量化統(tǒng)計(n=5)注：與對照組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

本研究選擇了杏仁核慢性電點燃癲癇模型，模擬了臨床常見的顳葉癲癇發(fā)作，且避免了化學(xué)點燃物質(zhì)對孕鼠胎兒的影響。本實驗?zāi)Ｐ驮O(shè)計上，成年雌鼠受孕前先構(gòu)建癲癇完全點燃模型，相比于受精后再點燃癲癇模型，癲癇發(fā)生后受精更符合臨床實際情況。由于胎鼠神經(jīng)發(fā)育損傷依賴于外界持續(xù)的刺激，因此，本研究孕鼠癲癇點燃會持續(xù)至分娩。仔鼠出生時，各組體重與體長沒有明顯差異，但仔鼠生長過程中，模型組仔鼠體重和體長都明顯低于對照組。仔鼠在翻正反射、抓握方面也存在差異，與對照組相比，模型組仔鼠翻身反射時間增加，且抓握時間減少。Rajabzadeh等[5]人研究報道中也有顯示癲癇孕鼠生育能力受損，且子代健康狀況較差，主要表現(xiàn)為體重較輕、體長較短、大腦發(fā)育較正常組遲緩。水迷宮測試中，與對照組相比，模型組仔鼠逃避潛伏期明顯增加，這也反映了仔鼠受大腦發(fā)育遲緩的影響，認(rèn)知功能明顯受損。因此，本研究認(rèn)為母體癲癇反復(fù)發(fā)作是造成胎兒各項機能發(fā)育遲緩的重要原因。

miR-146a是哺乳動物體內(nèi)一種常見的內(nèi)源性非編碼RNA，參與Toll樣受體和細(xì)胞因子受體信號調(diào)節(jié)。與正常人相比，局灶性癲癇患者其血清中miR-146a含量升高，對于頻發(fā)全身性癲癇患者，其血清中miR-146a含量更高。本研究顯示，與對照組相比，模型組仔鼠腦組織中miR-146a含量明顯升高。此外，其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中也有顯示，miR-146a表達(dá)升高不僅會通過Toll樣受體誘導(dǎo)炎癥反映，甚至引起神經(jīng)元凋亡。因此，miR-146a在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可能是誘導(dǎo)神經(jīng)凋亡的重要因子。神經(jīng)凋亡也是造成大腦發(fā)育遲緩，損傷認(rèn)知功能的主要因素。本研究采用了尼氏染色是評估神經(jīng)元狀態(tài)，在神經(jīng)元細(xì)胞代謝功能旺盛的神經(jīng)元中尼氏體特別豐富，而當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞受到損傷或者過度疲勞時，尼氏體出現(xiàn)解體，減少甚至消失[6]。本研究結(jié)果顯示，模型組尼氏染色細(xì)胞減少，反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損，與此同時，神經(jīng)元樹突棘萎縮會造成突觸形成受損。由于突觸是樹突棘之間電信號傳遞的生理基礎(chǔ)，而信息傳遞則是記憶儲存提取的前提[7]。Dong[8]研究中指出，母胎接觸神經(jīng)毒性物質(zhì)會通過胎盤傳遞給子代，通過下調(diào)Rac1/PAK/LIMK1/cofilin信號通路，影響突觸結(jié)構(gòu)和樹突棘發(fā)育，損害海馬突觸可塑性，導(dǎo)致子代認(rèn)知能力的降低。因此，miR-146a表達(dá)增加誘發(fā)的神經(jīng)凋亡與樹突棘萎縮共同反映了仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損傷，與Morris水迷宮中仔鼠逃避潛伏期增加相關(guān)。然而，對于miR-146a抑制劑組，母體懷孕期間靜脈注射miR-146a抑制劑，通過胎盤傳遞造成仔鼠腦組織中miR-146a表達(dá)降低，尼氏小體細(xì)胞數(shù)量增加，樹突棘密度與長度增加，提示降低miR-146a表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)母體癲癇的影響，促進仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，提高仔鼠遠(yuǎn)期認(rèn)知能力。

綜上所示，母體孕期癲癇完全點燃造成仔鼠腦組織中miR-146a表達(dá)增加，miR-146a是影響仔鼠體格生長和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的危險因素，降低miR-146a表達(dá)能夠明顯促進仔鼠體格生長，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，提高樹突棘密度與長度，改善仔鼠遠(yuǎn)期的認(rèn)知功能。