依托咪酯調節MAPK/ERK信號通路對骨關節炎大鼠軟骨損傷的影響

甘志強， 張 丹， 陳 印， 廖 飛

(四川省達州市中西醫結合醫院麻醉科， 四川 達州 635000)

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種最普遍的退行性關節疾病，最常發生在膝關節，主要表現為軟骨退化、滑膜炎癥、韌帶鈣化、軟骨下骨增厚。輕度骨關節炎的會出現關節僵硬、疼痛和水腫等癥狀；嚴重者會導致骨關節功能障礙，無法正常行動[1,2]。因此，對恢復軟骨損傷的研究在骨關節炎治療過程中存在巨大作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是細胞內的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，該家族還包括細胞外信號調節激酶(ERK)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38[3]。有研究表明MAPK/ERK信號通路能夠調節細胞增殖、分化、凋亡等過程，ERK磷酸化被抑制能夠減輕滑膜炎癥和軟骨損傷[4,5]。依托咪酯(Etomidate，ET)是一種短效的靜脈麻醉劑，有較強的抗應激和抗炎作用。據了解依托咪酯能夠保護軟骨細胞免受氧化應激，減輕細胞衰老[6]。基于上述發現，推測依托咪酯在OA治療中有潛在作用，但其具體作用和機制還未知。因此本研究建立骨關節炎大鼠，探討依托咪酯對其軟骨損傷的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料:SPF級SD雄性大鼠72只，6周齡體重180～200g，購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SYXK(粵)2022-0002。飼養條件：溫度24～26℃，濕度60%，本研究經動物倫理委員會批準。

1.2藥品及試劑:依托咪酯，購自于江蘇恩華藥業股份有限公司，國藥準字H32022992；雙氯芬酸鈉注射液購自于輔仁藥業集團有限公司，國藥準字H20068165；蘇木素和伊紅染液均購自于北京索萊寶科技有限公司；TNF-α、IL-1β、COMP ELISA試劑盒均購自于武漢武漢賽培生物科技有限公司；p-ERK1/2、ERK1/2、MMP-13一抗購自于英國Abcam生物公司；山羊抗大鼠IgG二抗購自于艾美捷科技有限公司有限公司；雙足平衡測痛儀購自于安徽耀坤生物科技有限公司；電子壓痛儀購自于上海軟隆科技發展有限公司；熱板測痛儀購自于上海玉研科學儀器有限公司；凝膠成像儀購自于Miulab公司，型號GIS-500。

1.3骨關節炎大鼠模型制備:參照文獻[7]采用MIA注射法建立骨關節炎大鼠模型，將部分實驗大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)，然后在大鼠后肢右側膝關節腔內注射碘乙酸(1mg/kg)，正常飼養2周后，發現大鼠骨關節腫脹并疼痛，影響行走，表示建模成功。假手術組大鼠注射等量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。

1.4動物分組和給藥:造模成功后，將所有大鼠分為假手術組、模型組、陽性組、ET低、中、高劑量組，平均每組12只。陽性組腹腔注射給予15mg/kg的雙氯芬酸鈉，ET低、中、高處理組分別腹腔注射給予1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg三個劑量，假手術組和模型組大鼠均以相同方式注射等體積的純凈水，每天1次，持續14d。

1.5評估各組大鼠關節水腫大小和承重不對稱性:給藥結束后，用游標卡尺分別測量各個實驗組大鼠左右后肢膝骨關節處的寬度，并將左右膝關節寬度之差記為水腫的大小。然后再將各組大鼠的左右后肢放在雙足平衡測痛儀的玻璃室當中，并保持大鼠直立且安靜，保證準確檢測體重在兩后肢分配情況，對兩后肢均進行3次測量，取平均值。

1.6檢測各組大鼠壓痛閾值和熱痛閾值:利用電子壓痛儀檢測大鼠的壓痛閾值，將大鼠用電子壓痛儀的固定簡固定，用壓痛儀的扁形頭對大鼠右后足施壓，當大鼠開始掙扎或發出叫聲時所產生的壓力值即為壓痛閾值。隨后采用熱板測痛儀檢測大鼠的熱痛閾值，將大鼠放置在熱平板上，從大鼠開始接觸熱平板至出現抬起或舔足行為的時間即為熱痛閾值，每只大鼠均測量3次，并取平均值。

1.7HE染色觀察各組大鼠軟骨病理損傷情況，進行Mankin評分:將各組大鼠麻醉后，分別在尾靜脈進行采血，血液樣本靜置10min后，4℃ 3000×g離心10min，取上清保存于-80℃。大鼠全部麻醉取血后，打開大鼠右后肢膝關節腔，取軟骨組織部分(n=6)放置于-80℃保存，部分(n=6)放置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋并切片。然后，分別用二甲苯和不同濃度梯度的乙醇對石蠟切片脫蠟。脫蠟完成后清洗樣本，用蘇木精染色10min，清洗后放入伊紅染液復染5min。再由高到低放入不同濃度梯度的乙醇，二甲苯透明。最后，中性樹脂固定封片。光學顯微鏡下觀察軟骨組織的病理變化并拍照。按Mankin評分標準對軟骨損傷程度進行評分：0分：正常；1分：表面不規則；2分：血管翳形成；3分：裂縫進入過渡層；4分：裂縫進入輻射層；5分：裂縫進入鈣化層；6分：結構完全被破壞。

1.8TUNEL檢測OA大鼠軟骨細胞凋亡:將1.7中的軟骨石蠟切片用0.2%Triton X-100孵育5min，PBS清洗，再按照TUNEL試劑盒說明加入工作液，37℃避光孵育1h，PBS清洗3次，用DAPI復染10min，PBS清洗后封片，熒光顯微鏡觀察并計算細胞凋亡率。

1.9ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平:將1.7中保存的血清置于冰上解凍，隨后按照ELISA試劑盒說明書相應的操作步驟檢測IL-1β、TNF-α、COMP在大鼠血清中的表達水平。

1.10蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠軟骨組織中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表達情況:將1.7中保存的軟骨組織進行研磨，并加入蛋白裂解液制備蛋白樣品，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳。然后在冰上進行轉膜實驗，轉膜電壓為100V，時間1h，結束以后拆除轉膜裝置取出 PVDF 膜，TBST 洗膜，用BSA封閉液室溫振蕩孵育2h，洗膜，加入用脫脂奶粉配置的一抗稀釋液(MMP-13、 p-ERK1/2、 ERK1/2抗體稀釋倍數 1∶2000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入羊抗鼠IgG二抗稀釋液(稀釋倍數1∶1000)，室溫振蕩孵育2h，洗膜后用ECL避光充分顯色，然后用凝膠成像儀觀察蛋白表達情況。以GAPDH為內參蛋白，分析蛋白表達量。

2 結 果

2.1ET對OA大鼠關節水腫和承重不對稱的影響:與假手術組相比，模型組OA大鼠關節水腫和承重不對稱性均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、ET低、中、高劑量組大鼠關節水腫和承重不對稱性均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見表1。

表1 ET對OA大鼠關節水腫大小和承重不對稱性的影響

2.2ET對OA大鼠壓痛閾值和熱痛閾值的影響:與假手術組相比，模型組中OA大鼠右后肢的壓痛閾值和熱痛閾值均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、ET低、中、高劑量組右后肢的壓痛閾值和熱痛閾值均升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見表2。

表2 ET對OA大鼠壓痛閾值和熱痛閾值的影響

2.3ET對OA大鼠軟骨組織形態和Mankin評分的影響:HE染色結果顯示，假手術組的軟骨組織結構正常，細胞排列整齊；與假手術組相比，模型組軟骨組織缺損，細胞數量減少，軟骨層變薄，Mankin評分升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組和ET低、中、高劑量組軟骨損傷被逐漸修復，細胞數量增多，排列均勻，軟骨層變厚，Mankin評分降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見圖1和表3。

圖1 ET對OA大鼠軟骨組織形態的影響(HE染色，×200)

表3 ET對OA大鼠軟骨組織Mankin評分情況

2.4ET對OA大鼠軟骨組織細胞凋亡的影響:與假手術組相比，模型組OA大鼠軟骨細胞凋亡率升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、ET低、中、高劑量組軟骨細胞凋亡率降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見下圖2和表4。

表4 各組OA大鼠軟骨細胞凋亡率

圖2 ET對OA大鼠軟骨細胞凋亡率的影響(×200)

2.5ET對OA大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β及COMP水平的影響:與假手術組相比，模型組OA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP含量升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、ET低、中、高劑量組血清中TNF-α、IL-1β、COMP含量降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見表5。

表5 ET對大鼠血清中TNF-α IL-1β COMP水平的影響

2.6ET對OA大鼠軟骨組織中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響:與假手術組相比，模型組OA大鼠軟骨組織中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表達及p-ERK1/2/ERK1/2比例升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、ET低、中、高劑量組軟骨組織中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表達及p-ERK1/2/ERK1/2比例降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，且ET高劑量組與陽性組無顯著差異(P>0.05)，詳見圖3和表6。

表6 ET對OA大鼠軟骨組織中MMP-13 ERK1/2 p-ERK1/2蛋白的影響

圖3 各組大鼠軟骨組織中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響A：假手術組；B：模型組；C：陽性組；D：ET低劑量組；E：ET中劑量組；F：ET高劑量組

3 討 論

OA是老年人中常見的一種關節病，主要是由外力造成的創傷或者是與年齡相關的軟骨損傷引起的。OA的主要特征是關節器官衰竭，對關節內和其周圍的組織產生影響，包括軟骨退化、滑膜炎癥等[8]。這些損傷引起的慢性疼痛、關節水腫等癥狀嚴重影響患者的正常生活質量。本研究建立了OA大鼠模型，通過檢測大鼠膝關節水腫情況、承重不對稱性以及大鼠痛閾值發現，模型組大鼠較假手術組比，膝關節水腫嚴重，兩后肢承重明顯不對稱，且右后肢痛閾值明顯降低；HE染色也表現出明顯的軟骨組織缺損，軟骨層變薄，細胞數量減少且分布紊亂，Mankin評分升高，說明OA大鼠模型建立成功。ET是一種靜脈麻醉劑，對多種疾病存在藥理作用，有研究指出ET能夠抑制IL-1β誘導的細胞氧化應激和衰老，對軟骨細胞產生保護作用[6,9]。本研究實驗結果發現，與模型組相比，陽性組和ET低、中、高劑量組中大鼠的關節水腫情況和承重不對稱性明顯有所減緩，且痛閾值也明顯升高；HE染色顯示軟骨組織損傷修復，軟骨層變厚，細胞數量增加且排列有序，Mankin評分降低，軟骨細胞凋亡率降低。揭示了ET能夠減輕OA大鼠關節水腫、疼痛以及軟骨組織病理形態的損傷。

MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，是調節多種細胞活動的主要信號通路，而ERK是MAPK家族的一種細胞外信號調節激酶。目前已知的MAPK的級聯反應有4種，其中MAPK/ERK信號通路參與細胞增殖和分化[5]。據了解，MAPKs的抑制劑通過恢復OA中受損的自噬對機體產生保護作用，ERK被激活后也能夠介導OA在內等多種疾病的增殖，例如ERK的磷酸化程度的降低能夠抑制MAPK信號通路，緩解類風濕關節炎帶來的軟骨損傷[10]。促炎細胞因子IL-1β是OA中最重要的損傷因子之一，能誘導炎癥介質和MMP的釋放。其中MMP13已被證明是是軟骨病理性破壞的關鍵酶，是OA發展過程重要的角色[11]。COMP常表達于健康軟骨中，是診斷OA的重要指標，在軟骨出現損傷時被釋放至血清中，其在血清中的水平可預測OA的發展進程[12]。本研究結果顯示，模型組OA大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β及COMP的水平升高，軟骨組織中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表達及p-ERK1/2/ERK1/2比例升高；陽性組和ET低、中、高劑量處理后血清中促炎因子TNF-α、IL-1β及COMP的水平明顯降低，MMP-13、p-ERK1/2蛋白表達及p-ERK1/2/ERK1/2比例顯著降低。揭示了ET能夠抑制炎癥反應，減輕軟骨組織損傷，并且抑制ERK1/2的磷酸化活化。

綜上所述，ET能夠通過減輕OA大鼠的軟骨組織損傷，減輕骨關節疼痛和腫脹等癥狀，其作用機制可能與抑制MAPK/ERK信號通路的活化有關。本研究為治療OA提供了新的思路和藥劑，但有研究顯示ET不僅可以作為膿毒癥的誘導劑，其高劑量使用也可以增加其他心血管疾病發生的風險，還會引起呼吸系統和中樞神經系統的不良反應[13]。因此，ET在OA及其他疾病上的作用劑量范圍和不良因素還需在臨床試驗之前進一步研究和測試。