右美托咪定調控miR-150-5p/P2X7受體軸減輕腦出血大鼠小膠質細胞活化

周華勇， 趙玉萍， 楊 旭， 張珊珊， 季一飛

(四川省南充市中心醫院/川北學院第二臨床學院神經內科， 四川 南充 637000)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指腦實質非外傷性內血管破裂導致的出血，是腦卒中的一種類型，具有較高的發病率、致殘致死率，嚴重影響生命健康。因此，研究ICH發病機制以及尋找防治新靶點在臨床上具有重要意義。研究表明[1]，ICH發生時，小膠質細胞(microglia,MG)作為中樞神經系統的重要免疫防線，首先做出反應，其活化后參與調控腦損傷引起的炎性反應，在神經損傷反應過程中起到關鍵作用。臨床上右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)廣泛用于重癥病患的鎮靜、鎮痛。大量研究證實，DEX具有抑制炎性反應、抗氧化、抗凋亡等作用，對腦、心肌等多種組織器官缺血再灌注損傷具有保護作用[2]。近年來有研究表明[3]，DEX能夠通過抑制MG活化以及P2X7受體(Purinergic P2X7 receptor,P2X7R)激活發揮腦保護作用。但臨床上DEX對ICH造成的腦損傷的作用研究較少。現已發現微小RNA(microRNA)作為重要的基因調控分子，在機體炎性反應和免疫應答中發揮重要作用[4]。研究顯示，miR-150-5p在膠原酶誘導的出血性中風大鼠的血漿中表達上調[5]，但其在ICH大鼠中的作用還未有研究。本文通過構建ICH大鼠模型，旨在探討DEX對ICH大鼠MG活化的影響以及miR-150-5p/P2X7R軸的調控作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級雄性SD大鼠65只，6周齡，體質量200-220g(廣州中醫藥大學，許可證號為SCXK(粵)2018-0034)。飼養環境為：溫度(22-25)℃，濕度為50%～55%，晝夜交替為12h∶12h。實驗前適應性飼養1周，期間自由采食飲水。所有動物實驗均按照本院國家衛生研究院和倫理委員會發布的《實驗動物護理與使用指南》進行，且符合動物的3R原則。

1.2實驗藥物與試劑:DEX(四川省維克奇生物科技有限公司)；miR-150-5p antagomir及其陰性對照NC antagomir(百奧邁科生物技術有限公司)；HE染色試劑盒、TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒、TRIzol試劑盒和DAB顯色試劑盒(均購買于北京索萊寶)；SuperScript IV反轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；P2X7R抗體(美國EMD Millipore公司)；Iba-1抗體(Alexa Fluor?488熒光)、β-actin抗體、羊抗兔IgG(HRP標記)(英國Abcam公司)；miR-negative control(NC)、miR-150-3p mimics(上海漢恒生物科技有限公司)；293T細胞(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)。

1.3大鼠的分組及處理:將大鼠分為假手術(sham)組(n=12)與模型(model)組(n=63)。參照文獻[6]方法建立ICH大鼠模型：大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，在腦立體定位儀上固定大鼠頭部，對正中部位的頭皮進行消毒、切口，然后分離骨膜，暴露冠狀縫、前囪。在前囪前2.0mm、中線右側3.0mm的地方鉆一個1.0mm直徑的圓孔，使用微量注射器經股動脈抽取血液50μL，并將其緩慢注射至圓孔內(速度2μL/min)，微量注射器在原地停留10min，以防止回流，最后將傷口縫合，并進行消毒以防感染。通過觀察主要出血部位是海馬CA2區，出血量約25%。提尾時自行向右側轉圈或內收為造模成功標準[7]。造模成功的大鼠隨機分為DEX低劑量(DEX-L)組、DEX高劑量(DEX-H)組、DEX+NC antagomir組和DEX+miR-150-5p antagomir組，每組12只。DEX低劑量組腹腔注射DEX 25μg/kg，DEX高劑量組腹腔注射DEX 50μg/kg，DEX+NC antagomir組腹腔注射DEX 50μg/kg和NC antagomir(20nmoL/L)5μL，DEX+miR-150-5p antagomir組腹腔注射DEX 50μg/kg和miR-150-5p antagomir(20nmoL/L)5μL，假手術組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，每次0.2mL，連續給藥7 d。

1.4神經功能評分:末次給藥結束后24h，根據改良后的Garcia行為學評分法[8]從自主運動(0～3分)、體態對稱性(1～3分)、前肢伸展運動(0～3分)、兩側胡須觸摸反應(1～3分)、抓持和攀爬鐵籠能力(1～3分)和兩側身體觸覺反射(1～3分)6個方面對各組大鼠進行神經功能評分，得分總和作為最終神經功能評分，分數越低提示神經功能損傷越嚴重，功能正常時得分最高為18分，功能損傷最嚴重時得分最低為3分。

1.5ELISA檢測血清TNF-α、IL-1β含量:神經功能評分結束后，經頸靜脈取血0.5mL，離心分離血清，按照ELISA試劑盒說明書繪制標準曲線，計算TNF-α、IL-1β含量。

1.6腦組織含水量的測定:取血完成后，每組隨機挑選4只大鼠，稱重后麻醉，斷頸處死大鼠取腦組織，濾紙吸取腦組織表面液體稱取濕重，置于100℃烘箱中24h后稱取干重。根據干濕重法計算腦組織含水量：含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7HE染色觀察腦組織病理變化:各組隨機選取4只大鼠，取出血區腦組織，固定后制備常規石蠟切片，HE染色后置于光學顯微鏡下觀察大腦皮層病理變化。

1.8免疫熒光觀察MG細胞形態:取1.7制備好的石蠟切片，進行脫蠟處理，運用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗，修復后，加入2%牛血清白蛋白(BSA)封閉1h，漂洗后加入兔抗鼠Iba-1一抗(1∶500)，4℃孵育過夜，再次漂洗后加入二抗(1∶1000)，室溫孵育1h，PBS漂洗，光學顯微鏡下觀察MG細胞形態。顯微鏡下拍照后采用ImageJ軟件對陽性染色細胞進行計數。

1.9qRT-PCR法檢測腦組織miR-150-5p、P2X7R mRNA相對表達:取剩余大鼠，處死后分離出血區腦組織，部分組織加入TRIzol試劑提取總mRNA，逆轉錄合成cDNA，以U6、β-actin為內參進行qRT-PCR擴增，檢測miR-150-5p、P2X7 mRNA相對表達。實驗結果采用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10Western blot法檢測腦組織Iba-1、P2X7R蛋白表達:加入蛋白裂解液提取1.9剩余大鼠出血區腦組織總蛋白，采用BCA法檢測總蛋白濃度。取30μg蛋白上樣進行電泳、轉膜，TBST清洗后加入4%脫脂牛奶封閉2h，加入Iba-1(1∶500)、P2X7R(1∶1000)、β-actin(1∶1000)一抗，4℃孵育過夜，TBST清洗后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶2500)。室溫下孵育2h，TBST清洗后利用DAB顯色試劑盒顯色，凝膠成像系統拍照，分析條帶灰度值。目標蛋白相對表達量=目的條帶灰度值/內參(β-actin)條帶灰度值。

1.11雙熒光素酶報告基因實驗:通過TargetScan數據庫預測miR-150-5p的下游靶基因可能為P2X7R。PCR擴增P2X7R mRNA與miR-150-5p潛在的野生結合位點，構建P2X7R野生型(P2X7R-WT)和突變型(P2X7R-MUT)重組質粒載體，將miR-NC、miR-150-5p mimics與P2X7R-WT、P2X7R-MUT共同轉染至293T細胞上，37℃培養箱培養48h后，收集并裂解細胞，使用雙熒光素酶報告基因分析。

2 結 果

2.1DEX對ICH大鼠神經功能評分的影響：給藥7d后，與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，DEX低、高劑量組大鼠神經功能評分均明顯升高(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組神經功能評分顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠神經功能評分的比較

2.2DEX對ICH大鼠血清中炎性因子含量以及腦組織含水量的影響：與假手術組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量以及腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量及腦組織含水量明顯降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組上述指標水平顯著升高(P<0.05)。見表3、表4。

表3 各組大鼠血清中TNF-α IL-1β含量的比較

表4 各組大鼠腦組織含水量的比較

2.3DEX對ICH大鼠腦組織病理學變化的影響：假手術組大鼠腦組織中未見出血灶，大腦皮質細胞形態正常，排列規律，結構整齊；模型組大鼠腦組織中大量紅細胞與炎性細胞浸潤，細胞排列凌亂，出現溶解壞死和核固縮現象；DEX各劑量組病理變化逐漸減輕，紅細胞與炎性細胞數量減少，核固縮現象減少；DEX+NC antagomir組的病理變化與DEX-H組的基本一致；DEX+miR-150-5p antagomir組可見大量紅細胞和炎性細胞浸潤，大腦皮質細胞結構紊亂，細胞排列無序。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化(HE,×400)

2.4DEX對ICH大鼠MG細胞形態變化的影響：假手術組MG數量較少，且胞體小，分支與突起細長，未見活化；與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中MG數量明顯增加，胞體變大，細胞突起與分支縮短變粗，MG活化；與模型組比較，DEX各劑量組MG數量明顯減少，胞體變小；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組MG數量顯著增多，胞體變大。見圖2。定量分析結果顯示，6組MG數量差異有統計學意義(F=126.561，P=0.000)；模型組MG數量[(139.46±12.38)個/視野]明顯多于假手術組[(3.59±0.41)個/視野](P<0.05)，DEX低、高劑量組MG數量[(98.67±11.42)個/視野、(43.79±6.21)個/視野]明顯少于模型組(P<0.05)，DEX+miR-150-5p antagomir組MG數量[(119.72±12.48)個/視野]明顯多于DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組[(45.86±6.25)個/視野](P<0.05)。

圖2 各組大鼠腦組織中MG形態的變化(免疫熒光,×400)

2.5DEX對ICH大鼠腦組織中miR-150-5p、P2X7R mRNA表達的影響：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中miR-150-5p表達顯著降低(P<0.05)，P2X7R mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組大鼠腦組織中miR-150-5p表達顯著升高(P<0.05)，P2X7R mRNA表達顯著降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組腦組織中miR-150-5p表達顯著降低(P<0.05)，P2X7R mRNA表達顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腦組織中miR-150-5p P2X7R mRNA表達的比較

2.6DEX對ICH大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達的影響：與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，DEX各劑量組Iba-1、P2X7R蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與DEX高劑量組、DEX+NC antagomir組比較，DEX+miR-150-5p antagomir組腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖3、表6。

表6 各組大鼠腦組織中Iba-1 P2X7R蛋白表達的比較

圖3 各組大鼠腦組織中Iba-1、P2X7R蛋白表達A：sham；B：model；C：DEX-L；E：DEX-H；E：DEX+NC antagomir；F：DEX+miR-150-5p antagomir

2.7P2X7R是miR-150-5p的下游靶基因：通過Target Scan軟件對miR-150-5p的靶基因進行預測，P2X7R 3’端存在miR-150-5p的互補序列，見圖4。通過雙熒光素酶報告基因實驗對miR-150-5p的靶基因驗證發現，miR-150-5p mimics能夠顯著增加P2X7R-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，而對P2X7R-MUT的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見表7。

圖4 miR-150-5p靶向調控P2X7R表達

表7 熒光素酶活性的比較

3 討 論

ICH發病率高、致死率高，嚴重影響病患健康，但目前對于ICH尚無有效的防治手段。炎性反應是ICH后導致腦損傷的主要病理機制，MG是神經系統中主要的免疫細胞，其活化后促進組織TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌[9]。本研究結果表明ICH模型大鼠神經功能評分下降，腦組織中大量紅細胞與炎性細胞浸潤，細胞排列凌亂，出現溶解壞死和核固縮現象，提示大鼠神經功能受損。免疫熒光法檢測MG形態變化，結果顯示ICH模型大鼠MG數量增加，胞體變大，細胞突起與分支縮短變粗；Iba-1是MG的一種主要標記抗體，ICH模型大鼠腦組織中Iba-1蛋白表達明顯升高，提示ICH后MG活化。此外，ICH模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量升高，進一步說明ICH造成的腦損傷與起機體炎性反應的發生相關。以上結果均提示ICH造模成功。

DEX已被證實具有減少炎性因子釋放，改善機體免疫、抑制氧化應激的作用[3]。已有研究顯示，DEX能夠改善ICH大鼠的神經功能損傷和氧化應激損傷并抑制神經細胞凋亡[10]。但DEX對MG活化的影響及調節機制尚不清楚。本研究結果表明，DEX干預后的ICH大鼠神經功能評分增加，血清中TNF-α、IL-1β含量下降，與上述研究相同，說明DEX能夠恢復ICH大鼠的神經功能，并減輕大鼠體內炎癥的發生。此外，我們還觀察到DEX干預使ICH大鼠腦組織病變減輕，MG數量減少，逐漸恢復靜息狀態，腦組織中Iba-1蛋白表達下降，提示DEX對ICH后MG活化具有抑制作用，且通過抑制MG活化減輕ICH大鼠炎癥的發生。

研究表明，P2X7R是主要在免疫細胞以及上皮細胞中表達的嘌呤受體離子通道，且DEX的作用機制與調控P2X7R通路有關[3]。另有研究表明，P2X7R能夠在中樞神經系統中表達，促進MG活化，誘導炎性因子的釋放，參與多種神經疼痛調節過程[11]。一些MicroRNA被證實在ICH炎性反應以及ICH引起的細胞凋亡等發生發展中起著重要作用[12]。既往研究顯示，骨關節炎患者外周血中miR-150與P2X7R mRNA水平呈負相關[13]，且本研究通過軟件預測和雙熒光素酶報告基因實驗結果表明，P2X7R確實是miR-150-5p的作用靶點。近期研究表明，miR-150-5p在老年急性缺血性腦卒中患者血清中下調表達，可作為診斷老年急性缺血性腦卒中的生物學標志物[14]。與此研究結果相似的是，本研究發現ICH模型大鼠腦組織中miR-150-5p表達降低，P2X7R mRNA和蛋白表達升高，二者趨勢正好相反，提示miR-150-5p、P2X7R參與ICH發生發展，可能在ICH大鼠中發揮靶向調控作用。深入研究發現，與模型組比較，DEX各劑量組大鼠腦組織中miR-150-5p表達升高，P2X7R mRNA和蛋白表達降低，提示DEX能夠上調ICH大鼠腦組織中miR-150-5p的表達，下調P2X7R表達，進而影響阻礙MG活化。DEX干預基礎上加入miR-150-5p antagomir后大鼠血清中炎性因子含量和Iba-1蛋白表達升高，組織結構病變加重，P2X7R表達升高，再次證實DEX能夠通過調控miR-150-5p/P2X7R軸抑制MG活化，進而減輕炎癥反應的發生，在ICH中發揮保護作用。

綜上所述，DEX可抑制MG活化，在ICH中發揮保護作用的機制可能與上調miR-150-5p、下調P2X7R表達有關。