橙皮素調節Keap1/Nrf2/ARE信號通路對D-半乳糖誘導的白內障大鼠氧化應激損傷的影響

李秋霞， 王廣謀， 陳 健， 王 華， 段國平

(1.湖南省人民醫院/湖南師范大學附屬第一醫院眼科, 湖南 長沙 410000 2.湖南省雙峰縣走馬街眼科診療中心眼科, 湖南 婁底 417700)

白內障(Cataract)是世界上常見的能夠導致失明的眼部疾病，其發生與年齡有關，而糖尿病也是引發白內障的原因之一，且該病患者發生白內障的時間更早，頻率也更高[1]。目前治療白內障的方法是通過手術摘除晶狀體后用人工晶狀體替換，但這種手術會產生角膜水腫和高眼壓等副作用[2]。因此，尋找治療白內障有效的方案及藥物是當前的重要任務。據研究可知，Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associating protein 1，Keap1)-核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)通路是抗氧化應激的重要通路，且在炎癥性疾病、糖尿病以及與年齡相關的眼病等疾病的恢復中發揮重要作用[3]。橙皮素是一種天然的生物類黃酮，具有明顯的抗炎、抗氧化、抗凋亡等功效，能夠保護心血管、葡萄糖代謝和神經系統[4]。研究已經證明橙皮素可以減輕糖尿病引起的大鼠視網膜氧化應激、神經炎癥和細胞凋亡，還可以抑制亞硒酸鹽誘導的白內障形成[5,6]，但其治療白內障的作用機制仍不清楚。因此，本實驗通過建立D-半乳糖白內障大鼠模型，探討橙皮素對其氧化應激損傷的影響以及對Keap1/Nrf2/ARE信號通路的調節作用。

1 材料與方法

1.1動物:SPF級Wistar雄性大鼠72只，8周齡體重180～210g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均在溫度24～26℃，濕度60%的環境中飼養。本研究經動物倫理委員會批準。

1.2藥品及試劑:橙皮素，純度：HPLC≥98%，購自于四川省維克奇生物科技有限公司；復明膠囊，購自于陜西君壽堂制藥有限公司，國藥準字Z20060308；D-半乳糖，純度：HPLC≥99%，購自于浙江一新制藥股份有限公司；復方托吡卡胺滴眼液，購自于沈陽興齊眼藥股份有限公司，國藥準字H20123453；Nrf2抑制劑ATRA購自于美國MedChemExpress(MCE)；蘇木素和伊紅染液均購自于上海經科化學科技有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)購自于碧云天生物有限公司；BSA檢測試劑盒均購自于上海江萊生物科技有限公司；SOD、CAT、GSH-Px ELISA試劑盒均購自于武漢賽培生物科技有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1一抗購自于英國Abcam生物公司；山羊抗大鼠IgG二抗購自于亞科因(武漢)生物技術有限公司；裂隙燈顯微鏡購自于上海涵飛醫療器械有限公司；熒光顯微鏡購自于olympus；凝膠成像儀購自于美國伯樂BIO-RAD。

1.3D-半乳糖誘導的白內障大鼠模型制備:參照文獻[7]制備D-半乳糖誘導的白內障大鼠模型。全部大鼠先正常飼喂一周，然后挑取部分大鼠每天皮下注射200mg/kg的D-半乳糖，持續8周。假手術組每天注射等量的無菌水，其它飼喂條件相同。4周后，在裂隙燈下觀察大鼠的晶狀體，出現渾濁即為造模成功。

1.4動物分組和給藥:將所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組、橙皮素低、高劑量組、橙皮素高劑量+Nrf2抑制劑ATRA組，每組12只。在造模第5周時，陽性對照組大鼠灌胃30mg/kg的復明膠囊，橙皮素低、高劑量組分別以50mg/kg、150mg/kg灌胃給藥，橙皮素高劑量+ATRA組先灌胃100mg/kg橙皮素，再腹腔注射10mg/kg的ATRA[8]。假手術組和模型組均注射等量的生理鹽水。每天1次，持續給藥4周。

1.5觀察大鼠晶狀體組織渾濁程度:在實驗結束后，用復方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠的所有晶狀體的渾濁程度：0級：晶狀體無異常；1級：晶狀體周圍出現空泡；2級：空泡消失，晶狀體皮層出現朦朧；3級：晶狀體皮層完全渾濁，但核透明；4級：晶狀體核也出現渾濁，逐漸與皮層混為一體。等級越高說明渾濁程度越高。

1.6HE染色觀察大鼠晶狀體上皮組織病理學變化:將所有大鼠麻醉后處死，隨機選取6只大鼠的左眼晶狀體置于4%多聚甲醛中固定過夜后制備石蠟切片；右眼晶狀體用于ELISA檢測；其余6只大鼠的晶狀體，保存在-80℃備用。將晶狀體切片用二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液脫蠟；PBS清洗，然后蘇木素染液染色10min，置于1%鹽酸中分化5s，PBS沖洗后用伊紅染液復染5min，染色結束后用乙醇溶液脫水，二甲苯透明，最后晾干并用中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察晶狀體上皮組織的病理形態。

1.7TUNEL法檢測晶體上皮組織細胞凋亡率:將1.6中的石蠟切片分別用二甲苯和乙醇充分脫蠟和水化，然后將切片放入先前配制好的TUNEL反應混合液中，37℃孵育60min。PBS沖洗后，用DAPI進行細胞核染色，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。置于熒光顯微鏡下觀察并拍照計算凋亡率。

1.8ELISA檢測晶狀體中氧化應激指標SOD、CAT、GSH-Px的活性:將1.6中6只大鼠的右眼晶狀體分別放入研磨器加入適量生理鹽水搗碎，1000×g離心10min，取上清液。然后按照ELISA試劑盒的操作步驟分別檢測晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px的表達水平。

1.9Western blotting檢測大鼠晶狀體組織中通路蛋白Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表達水平:取6只大鼠的左眼晶狀體分別置于勻漿器中，分別加入細胞質和細胞核蛋白提取液進行勻漿，并制備蛋白樣品。bcA試劑盒檢測蛋白濃度后，上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴轉膜。將轉膜后的PVDF膜放入封閉液中室溫孵育2h，加入一抗稀釋液(Keap1、Nrf2抗體稀釋倍數1∶1000，HO-1抗體稀釋倍數1∶2000)，室溫孵育2h，洗膜后用羊抗鼠二抗稀釋液室溫孵育2h，最后加入發光試劑顯色，凝膠成像儀拍照并分析蛋白含量，細胞核Nrf2以H3為內參蛋白，其它蛋白以β-actin為內參蛋白。

2 結 果

2.1橙皮素對白內障大鼠晶狀體組織渾濁程度的影響:與假手術組相比，模型組中大鼠晶狀體渾濁程度顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體渾濁程度顯著降低(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體渾濁程度顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各實驗組大鼠晶狀體組織渾濁程度

2.2橙皮素對白內障大鼠晶狀體上皮組織病理學變化的影響:HE染色結果顯示，假手術組大鼠晶狀體上皮組織細胞排列整齊，形態正常；與假手術組相比，模型組大鼠晶狀體上皮組織細胞數量減少，排列紊亂，出現水腫且細胞間隙增大；與模型組相比，陽性對照組和橙皮素低、高劑量組上皮細胞逐漸增多，水腫情況減輕，排列有序且緊密；橙皮素高劑量+ATRA組與模型組形態相似。見圖1。

圖1 橙皮素對白內障大鼠晶狀體上皮組織形態的影響(HE染色，×400)

2.3橙皮素對白內障大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率的影響:與假手術組相比，模型組中大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體上皮細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見下圖2、表2。

圖2 TUNEL檢測各組大鼠晶狀體上皮細胞情況(綠色熒光，×400)

表2 TUNEL檢測各組大鼠晶狀體上皮細胞的凋亡率

2.4橙皮素對白內障大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性的影響:與假手術組相比，模型組中大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各實驗組大鼠晶狀體中SOD CAT GSH-Px活性的影響

2.5橙皮素對白內障大鼠晶狀體中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的影響:與假手術組相比，模型組中大鼠晶狀體中Keap1和細胞質Nrf2蛋白表達升高，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、橙皮素低、高劑量組大鼠晶狀體中Keap1和細胞質Nrf2蛋白表達降低，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達升高(P<0.05)；與橙皮素高劑量組相比，橙皮素高劑量+ATRA組大鼠晶狀體中Keap1和細胞質Nrf2蛋白表達升高，細胞核Nrf2和HO-1蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 橙皮素對白內障大鼠晶狀體中Keap1 Nrf2 HO-1蛋白的影響

圖3 不同實驗組白內障大鼠晶狀體中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表達

3 討 論

白內障是引發失明的主要原因，與晶狀體的氧化損傷有關，其主要特征表現為晶狀體渾濁、視力障礙和光散射。雖然白內障多發生于老年人，但是幼兒也可能因遺傳疾病而在出生時便患有白內障[9]。因此，深入研究白內障的發病機制對其預防和治療有重要作用。本研究建立白內障大鼠模型發現，模型組大鼠晶狀體渾濁程度較高，晶狀體上皮組織細胞排列不均勻，數量減少且水腫，細胞凋亡率也升高。揭示了白內障大鼠模型建立成功。橙皮素是從天然植物中提取的一種化合物，其具有抗炎癥、抗氧化、降血糖、抗腫瘤以及保護神經系統等廣泛的藥理作用。本研究結果發現，陽性對照組和橙皮素低、高劑量組分別給藥后，大鼠晶狀體渾濁程度降低，晶狀體上皮組織細胞數量增多，水腫程度減輕，細胞凋亡率也降低。表明了橙皮素能夠降低白內障大鼠晶狀體的渾濁程度和細胞凋亡率，減輕D-半乳糖誘導的晶狀體病理性損傷。

Keap1是細胞中調節Nrf2水平的主要因子之一，與Nrf2相互作用并維持Nrf2的穩定。當受到氧化條件刺激后，ROS的不斷產生使Keap1的半胱氨酸殘基失去泛素活性，導致Nrf2從細胞質轉移到細胞核中，并在細胞核中與ARE結合啟動下游HO-1等抗氧化基因的表達[10,11]。Keap1/Nrf2/ARE通路是抗氧化應激最重要的通路之一，參與心血管疾病、神經系統疾病、腫瘤等疾病的治療。研究證明，抑制Keap1激活Nrf2通路，能夠減輕糖尿病性白內障大鼠的氧化應激反應[12]。抗氧化合物CAT和GSH-Px能夠通過將過氧化物分解為H2O和O2來保護機體免受損傷，SOD是生命體的一種反應酶，可促進超氧化物歧化為O2和H2O2，并與CAT相互配合使機體保持氧化還原平衡[6,13]。本研究結果顯示，模型組中大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性、細胞核Nrf2、HO-1蛋白表達均降低，Keap1和細胞質Nrf2蛋白表達升高；在陽性對照組、橙皮素組給藥后大鼠晶狀體中SOD、CAT、GSH-Px活性、細胞核Nrf2、HO-1蛋白表達均升高，Keap1和細胞質Nrf2蛋白表達降低，揭示了橙皮素能夠通過抑制Keap1，促進細胞質Nrf2轉移至細胞核與ARE相關轉錄因子HO-1結合，提高抗氧化因子的活性。而加入Nrf2抑制劑ATRA后發現，大鼠晶狀體中的上述抗氧化因子的活性降低，通路相關蛋白表達趨勢也與橙皮素高劑量組相反。進一步揭示了橙皮素減輕白內障大鼠的氧化應激損傷的作用可能是通過調控Keap1/Nrf2/ARE信號通路實現的。

綜上所述，橙皮素可減輕D-半乳糖誘導的白內障大鼠氧化應激損傷，其作用機制可能與下調Keap1的表達，使Nrf2轉移至細胞核，促進HO-1等抗氧化基因表達有關。因此，橙皮素在白內障的治療中可能具有潛在作用。但是橙皮素對Keap1-Nrf2通路下游因子的作用機制還有待進一步深入研究。