LncRNA KCNQ1OT1調節miR-145/PAK4軸對結直腸癌SW480細胞惡性發展的影響

施 文， 周志強， 蔡 明， 邱 建， 陳錦鵬， 何向鋒， 孫永強

(南通大學第二附屬醫院/南通市第一人民醫院胃腸甲乳外科， 江蘇 南通 226000)

結直腸癌(CRC)是最常見的胃腸道腫瘤之一，近些年發病率不斷上升。自20世紀90年代初以來，結直腸癌在年輕人中的發病率幾乎翻了一番[1]。CRC篩查方案的實施提高了早期檢出率，但許多CRC患者仍處于晚期，往往失去了治療性切除的機會。因此，迫切需要研究新的生物標志物和靶點來改善結直腸癌的預后。長非編碼RNA(lncRNA)是一種長度超過200個核苷酸、缺乏能夠產生功能蛋白的開放閱讀框的非編碼轉錄本[2]。大量研究表明，lncRNA廣泛存在于人類細胞中，在細胞周期調控、細胞分化、腫瘤發生等各種生物事件中發揮著重要作用[3]。lncRNA被發現是相互競爭的內源性RNA，它們吞噬miRNA并調節miRNA的靶標。越來越多的證據表明，lncRNA在包括CRC在內的各種癌癥類型中存在失調，并且在所有癌癥特征中都發揮著不可或缺的作用[4]。KCNQ1反鏈/反義轉錄本1 (Opposite Strand/Antisense Transcript 1，KCNQ1OT1)基因位于11p15.5，是lncRNA組的成員。KCNQ1OT1與染色質相互作用，通過表觀遺傳修飾調控多個靶基因的轉錄。目前，關于其在腫瘤中的異常表達和功能的研究報道較少。Feng等發現LncRNA KCNQ1OT1調控microRNA-9-LMX1A表達，抑制胃癌細胞進展[5]。Qiao等指出LncRNA KCNQ1OT1通過miR-124-3p/TRIM14軸參與舌癌順鉑耐藥[6]。Li等發現LncRNA KCNQ1OT1通過靶向MiR-218-5p/HS3ST3B1促進膀胱癌的進展[7]。然而，KCNQ1OT1在CRC中的潛在分子機制尚未得到充分的研究。本研究旨在探討LncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌中的作用及其可能的機制研究，希望為結直腸癌患者的治療找到新的理論靶點。

1 材料與方法

1.1臨床標本：收集經組織病理學證實的CRC標本和術后患者匹配的正常組織，該研究得到了南通大學第二附屬醫院倫理委員會的批準以及患者書面知情同意。所有組織標本立即用液氮冷凍，置于-80℃保存至使用。

1.2方 法

1.2.1細胞系及細胞培養：人CRC細胞系SW480和正常結腸上皮細胞系CCC-HIE-2購自中國科學院細胞庫。SW480在L15培養基(美國Invitrogen)中培養，CCC-HIE-2在Dulbecco’s modified Eagle’s培養基中培養。所有培養基均添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素(美國HyClone)。所有細胞系在37℃、5% CO2條件下培養。

1.2.2質粒來源及細胞轉染：KCNQ1OT1和PAK4的干擾以及過表達質粒購自北京擎科生物有限公司，miR-145模擬物和抑制劑從GenePharma獲得，根據制造商的說明，用Lipofectamine 3000(中國賽默飛世爾科技)轉染質粒，用于后續實驗。

1.2.3雙熒光素酶報告基因檢測：pmirGLO質粒購自優寶生物(中國湖南長沙)。將KCNQ1OT1和PAK4的擴增序列克隆到pmirGLO質粒中。將相應擴增的突變序列插入質粒中，與限制性內切酶位點ScaI和XbaI一起構建突變載體。將構建的KCNQ1OT1和PAK4野生型載體與miR-145模擬物一起轉染到HEK293T細胞中，對照組細胞與模擬物對照質粒共轉染，另外一組細胞共轉染KCNQ1OT1和PAK4突變型載體與miR-145模擬物，最后檢測并分析雙熒光素酶活性。

1.2.4RNA分離及qRT-PCR檢測：用Trizol試劑(Sigma-Aldrich)從組織或細胞系中分離總RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)，隨機引物逆轉錄互補DNA(cDNA)。然后配置qRT-PCR反應體系，循環程序為98℃ 2min，98℃ 10s、60℃ 15s和65℃ 15s，40個循環。用公式2-△△Ct分析各目的基因的相對表達量。GAPDH為KCNQ1OT1和PAK4的內源性控制基因，U6為miR-145的內源性控制基因。引物信息見表1。

表1 引物序列

1.2.5MTT實驗：離心收集培養的細胞，以1×106/mL重懸，100μL細胞懸液置于微滴板中。培養48h后，每孔加10μL MTT試劑，再孵育3h。每孔加入100μL洗滌試劑，避光孵育2h。最后，在450nm微滴定板上觀察每個孔的光吸收度。所有試劑均購自Biomart(中國北京)。

1.2.6細胞克隆形成實驗：用4mL 0.25%胰蛋白酶消化培養的細胞，接種在6孔板中，培養7d。當細胞形成可見菌落時，取出培養基，在平板上加入固定液2～3mL。5min后棄固定液，加入0.5%結晶紫(上海Sigma-Aldrich)溶液與細胞孵育2h，在顯微鏡下觀察菌落。

1.2.7流式細胞儀分析細胞凋亡率：將細胞接種于24孔板中，孵育48h。收集上清液和貼壁細胞，使用FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD Biosciences)，用異硫氰酸熒光素-膜聯蛋白V和碘化丙啶進行雙重染色。將500μL細胞懸液與2μL Annexin(1mg/mL)和2μL碘化丙啶(1mg/mL)(CA1020，Solarbio，北京)孵育后，用流式細胞儀分析細胞凋亡率，將細胞區分為活細胞、死細胞、早期凋亡細胞和凋亡細胞，并比較各實驗中凋亡細胞與對照轉染細胞的相對比例。

1.2.8Western Blot檢測蛋白表達：收集細胞，從轉染細胞中提取蛋白，細胞蛋白裂解液用10% SDS-PAGE分離，轉移到PVDF膜，與特異性抗體孵育。以GAPDH抗體作為對照，anti-GAPDH和E-cadherin、N-cadherin購自Cell Signaling Technology。用超信號化學發光底物進行蛋白檢測。

1.3統計學處理：采用GraphPad Prism 6.0軟件進行數據分析。以上實驗至少進行了三次。數據以均數±標準差表示，兩組獨立樣本比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4在結直腸癌組織和細胞中的表達：結直腸癌組織中KCNQ1OT1、PAK4表達量高于癌旁組織(P<0.01)，miR-145表達量低于癌旁組織(P<0.01)；SW480細胞中KCNQ1OT1、PAK4表達量高于CCC-HIE-2細胞(P<0.01)，miR-145表達量低于CCC-HIE-2細胞(P<0.01)，見圖1和表2。

圖1 qRT-PCR技術檢測結直腸癌組織和細胞中LncRNA KCNQ1OT1、miR-145和PAK4的表達量

表2 不同組織和細胞中LncRNA KCNQ1OT1 miR-145和PAK4的差異表達量

2.2LncRNA KCNQ1OT1與miR-145以及miR-145與PAK4之間的關系：KCNQ1OT1和miR-145、miR-145與PAK4之間的結合位點見圖2。KCNQ1OT1 WT+miR-145 mimics組熒光素酶活性低于KCNQ1OT1 WT+mimics NC組(P<0.01)，PAK4 WT+miR-145 mimics組熒光素酶活性低于PAK4 WT+mimics NC組(P<0.01)，KCNQ1OT1與PAK4突變后熒光素酶活性與對照組比無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 熒光素酶活性分析

圖2 lncRNA KCNQ1OT1與miR-145、miR-145與PAK4之間的關系

2.3敲低KCNQ1OT1或PAK4表達對SW480細胞的增殖、凋亡及EMT的影響：與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組細胞增殖活力顯著下調(P<0.05)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組SW480細胞克隆數目顯著減少(P<0.01)；KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組N-cadherin表達顯著下調(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)；與siRNA NC組相比，KCNQ1OT1 siRNA組和PAK4 siRNA組細胞凋亡率顯著上調(P<0.01)，見圖3和表4。

表4 敲低KCNQ1OT1或PAK4表達后分析SW480細胞的增殖凋亡及

圖3 敲低KCNQ1OT1或PAK4表達對SW480細胞的增殖、凋亡及EMT的影響A：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達后MTT分析SW480細胞活力；B：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達后細胞克隆形成實驗檢測 SW480細胞克隆數目；C：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達后Western blot檢測細胞EMT；D：敲低KCNQ1OT1或PAK4表達后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

2.4敲低miR-145表達對SW480細胞的增殖、凋亡及EMT的影響：與inhibitor NC組相比，miR-145 inhibitor組細胞增殖活力顯著上調(P<0.05)，SW480細胞克隆數目顯著增加(P<0.01)，E-cadherin表達顯著下調(P<0.01)，N-cadherin蛋白表達顯著上調(P<0.01)，細胞凋亡率顯著下調(P<0.01)，見圖4和表5。

表5 敲低miR-145表達后分析SW480細胞的增殖凋亡及EMT

圖4 敲低miR-145表達對SW480細胞的增殖、凋亡及EMT的影響A：敲低miR-145表達后MTT分析SW480細胞活力；B：敲低miR-145表達后細胞克隆形成實驗檢測SW480細胞克隆數目；C：敲低miR-145表達后Western blot檢測細胞EMT；D：敲低miR-145表達后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

2.5LncRNA KCNQ1OT1表達上調通過miR-145對SW480細胞增殖、凋亡及EMT的影響：上調KCNQ1OT1表達后細胞增殖活力、細胞克隆數目、N-cadherin/GAPDH比值顯著高于對照組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.01)；上調miR-145表達后細胞增殖活力、細胞克隆數目、N-cadherin/GAPDH比值顯著低于對照組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)；KCNQ1OT1與miR-145同時上調組細胞增殖活力、細胞克隆數目、N-cadherin/GAPDH比值顯著高于miR-145單獨上調組(P<0.05)，E-cadherin/GAPDH比值和細胞凋亡率顯著低于miR-145單獨上調組(P<0.01)，見圖5和表6。

表6 LncRNA KCNQ1OT1表達上調通過miR-145對SW480細胞增殖凋亡及EMT的影響

圖5 LncRNA KCNQ1OT1表達上調通過miR-145對SW480細胞增殖、凋亡及EMT的影響A：上調LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達后MTT分析SW480細胞活力；B：調LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達后細胞克隆形成實驗檢測SW480細胞克隆數目；C：調LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達后Western blot檢測細胞EMT；D:調LncRNA KCNQ1OT1和miR-145表達后流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

3 討 論

研究發現，LncRNA參與了許多細胞生物學發展過程，且LncRNA在癌癥中的作用也得到了進一步證實。目前，許多作為內源性miRNA海綿的lncRNA已經被證明參與了CRC的惡性發展。如研究發現lncRNA SNHG11作為結直腸癌早期診斷和預后的新型生物標志物[8]。長鏈非編碼RNA GAS5通過與YAP磷酸化和降解相互作用并觸發YAP磷酸化和降解而抑制結直腸癌的進展。此外還發現LncRNA SNHG6通過靶向UPF1激活TGF-β/Smad信號通路，通過調控ZEB1誘導EMT，促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移[9]。鑒于LncRNA在結直腸癌發展中發揮的關鍵作用，揭示LncRNA新的作用機制對于防控結直腸癌具有深遠意義。有文獻報道LncRNA KCNQ1OT1參與了舌癌、胃癌等腫瘤的發展進程，此外還有研究發現LncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌中表達上調，通過cAMP信號通路調控miR-760/PPP1R1B，增強結直腸癌細胞對甲氨喋呤的耐藥[10]，表明LncRNA KCNQ1OT1與結直腸癌等腫瘤惡性發展息息相關。因此為了深入LncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌的作用機制，本研究首先檢測了結直腸癌組織和細胞中LncRNA KCNQ1OT1的表達情況，結果發現探討結直腸癌組織中KCNQ1OT1表達量高于癌旁組織，SW480細胞中KCNQ1OT1表達量高于CCC-HIE-2細胞，而本研究結果與之前的研究結果一致，LncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌組織和細胞中表達顯著上調。接下來研究LncRNA KCNQ1OT1的作用機制，敲低LncRNA KCNQ1OT1表達后，進一步檢測了SW480細胞的增殖活力與EMT能力，結果發現下調其表達通過促進癌細胞凋亡顯著抑制了結直腸癌細胞的增殖和EMT，LncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌細胞發展中發揮了明顯的抑癌作用，這與LncRNA KCNQ1OT1在舌癌、胃癌和膀胱癌中的功能相吻合。

越來越多的研究發現LncRNA通過靶向miRNA發揮作用，受此啟發，本研究預測了LncRNA KCNQ1OT1的下游作用靶點，結果發現LncRNA KCNQ1OT1與miR-145具有直接的靶向作用。miRNA是非編碼RNA家族的成員，在轉錄后基因調控中發揮著重要作用。大量研究表明，miRNA參與了腫瘤的形成和發展，提示它們可以發揮致癌或抑制腫瘤的作用。miR-145在癌癥發展過程中的作用機制在既往研究中得到越來越多的探討。Zhang等發現，miR-145通過抑制RAB5C在乳頭狀甲狀腺癌中發揮抑癌作用[11]。Li等發現在卵巢癌細胞中，miR-145通過c-myc和dnmt3a介導的甲基化促進miR-133b的表達。Wang等研究表明miR-145通過靶向ADAM19改變非小細胞肺癌對吉非替尼的敏感性[12]。本研究發現miR-145在結直腸癌組織和細胞中顯著低表達，下調miR-145通過抑制SW480細胞凋亡顯著促進細胞增殖和EMT。以往的研究揭示了lncRNA-miRNA-mRNA軸在包括CRC在內的各種癌癥中的不同調控機制。Xi等表明LncRNA LINC01278通過miR-134-5p/KDM2A軸加速大腸癌進展[13]。Qian等研究發現lncRNA LUNAR1通過靶向miR-495-3p/MYCBP軸加速大腸癌進展[14]。同樣，本研究證實了KCNQ1OT1的下調通過增加miR-145的表達來抑制PAK4的表達，從而抑制了SW480細胞的增殖和轉移。本研究進一步闡明了KCNQ1OT1/miR-145/PAK4網絡在結直腸癌中的調控機制。盡管我們的發現為KCNQ1OT1的下游靶點提供了新的見解，未來需要進行更多的研究，進一步闡明生物標志物的治療和預后價值。

綜上所述，本研究證實了lncRNA KCNQ1OT1在結直腸癌中的表達顯著增加，并且KCNQ1OT1似乎通過調控miR-145/PAK4軸發揮致癌基因的作用。這些發現為早期檢測患者提供了一種新的預后生物標志物，也為CRC患者提供了一個潛在的治療靶點。