定眩飲顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

田歡，祁慶瑞，王可欣，惠榮，翟秉濤，唐遠(yuǎn)山，岳寶森△

（1.陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046）

定眩飲由熟地、當(dāng)歸、白芍、麥冬等12 味中藥材組方，具有疏風(fēng)定眩、補(bǔ)血益精功效，主要用于治療營(yíng)血虛滯、風(fēng)擾清竅所致眩暈病，以及頸項(xiàng)僵硬、肩背酸痛、神疲乏力、倦怠懶言等癥，是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)高上林主任的臨床經(jīng)驗(yàn)方。方中，熟地、當(dāng)歸、川芎、白芍共為君藥，共奏補(bǔ)肝血、益腎精而通血痹之功效，體現(xiàn)了中醫(yī)理論“風(fēng)為百病之長(zhǎng)，治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”的理論。陜西省名中醫(yī)唐遠(yuǎn)山于2007 年至2022 年在陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院對(duì)此方的療效進(jìn)行臨床觀察，結(jié)果顯示其緩解頸源性眩暈的療效顯著［1-2］。但傳統(tǒng)湯劑煎煮工藝復(fù)雜，攜帶不便，且易變質(zhì)，使其臨床應(yīng)用受到限制，故擬將其開(kāi)發(fā)為院內(nèi)制劑定眩飲顆粒。定眩飲全方僅12味藥，藥味更精，針對(duì)性強(qiáng)，且均不屬貴重藥品，繼承了中醫(yī)的“簡(jiǎn)、便、驗(yàn)、廉、效”特色。項(xiàng)目組前期已完成定眩飲顆粒的制備工藝研究［3］。本研究中以薄層色譜（TLC）法定性鑒別定眩飲顆粒中的羌活、當(dāng)歸、炙甘草、白芍和熟地黃；以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制劑中白芍、當(dāng)歸、川芎、羌活和甘草5 味藥材中的芍藥苷、阿魏酸和甘草苷3種成分的含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS105DU 型分析天平（梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；KQ-400E 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

定眩飲顆粒（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為20211201，20211202，20211203）；熟地黃對(duì)照藥材（批號(hào)為121196-202007），當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)為120927-202118），半夏對(duì)照藥材（批號(hào)為121272-201806），干姜對(duì)照藥材（批號(hào)為120942-201911），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)為120904-202021），紫花前胡苷對(duì)照品（批號(hào)為111737-201910），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201943，純度為96.5%），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773-201915，純度為99.4%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)為111610-201908，純度為95.0%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；當(dāng)歸（批號(hào)為20200301），白芍（批號(hào)為20191101），麥冬（批號(hào)為20200201），姜半夏（批號(hào)為20191101），薄荷（批號(hào)為20200101），羌活（批號(hào)為20191201），天麻（批號(hào)為20200201），麩炒山藥（批號(hào)為20200202），炙甘草（批號(hào)為20191101），均購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司；熟地黃（批號(hào)為191102），川芎（批號(hào)為200501），砂仁（批號(hào)為180811），均購(gòu)于陜西康超康健藥業(yè)有限公司；上述藥材均經(jīng)陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院劉麥娥副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

白芍：取樣品8 g，50 mL乙醇超聲5 min，濾液蒸干，加1 mL乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺白芍的陰性對(duì)照品溶液；另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》0502 TLC 法試驗(yàn)，取上述3 種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，噴以5%香草醛硫酸溶液顯色，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［4］109。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 A。

炙甘草：取樣品6 g，40 mL乙醚回流1 h，濾過(guò)，藥渣加甲醇回流1 h，濾液蒸干，加適量水溶解，正丁醇萃取3次，合并濾液，水洗3次，揮干后殘?jiān)蛹状际谷芙猓鳛楣┰嚻啡芤海煌ㄖ苽涓什輰?duì)照藥材溶液及缺炙甘草陰性對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》0502 TLC 法試驗(yàn)，取上述3 種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm波長(zhǎng)）下檢視［4］88-89。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 B。

羌活：取樣品10 g，50 mL 甲醇超聲20 min，取上清液作為供試品溶液；同法制備缺羌活的陰性對(duì)照品溶液；另取紫花前胡苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》0502 TLC 法試驗(yàn)，取上述3 種溶液分別點(diǎn)于同一3%醋酸鈉制備的硅膠G 板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶2，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，置紫外光燈（365 nm波長(zhǎng)）下檢視［4］190。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1 C。

1.對(duì)照品溶液 1'.對(duì)照藥材溶液 2-4.供試品溶液 5.陰性對(duì)照品溶液A.白芍 B.炙甘草 C.羌活 D.熟地黃 E.當(dāng)歸圖1 定眩飲顆粒薄層色譜圖1.Reference solution 1'.Solution of reference medicinal materials 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Paeoniae Radix Alba B.Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praeparata Cum Melle C.Notopterygii Rhizoma Et Radix D.Rehmanniae Radix Praeparata E.Angelicae Sinensis RadixFig.1 TLC chromatograms of Dingxuanyin Granules

熟地黃：取樣品8 g，加水100 mL，加熱至沸，充分溶散，放冷，離心，取上清液，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，加1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備缺熟地黃的陰性對(duì)照品溶液；另取熟地黃對(duì)照藥材1 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》0502 TLC 法試驗(yàn)，取上述3 種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，噴以2，4-二硝基苯肼乙醇試液，日光下檢視［5］。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的黃色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 D。

當(dāng)歸：取樣品8 g，30 mL 乙醚超聲10 min，濾液揮干，加1 mL 乙醇使溶解，作為供試品溶液；同法制備當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液及缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照品溶液。照2020年版《中國(guó)藥典（四部）》0502 TLC法試驗(yàn)，取上述3種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，置紫外光燈（365 nm 波長(zhǎng)）下檢視［4］139。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 E。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min 時(shí)3%A～10%A，15～22 min 時(shí)10%A～12%A，22～30 min 時(shí)12%A～13%A，30～60 min 時(shí)13%A，60～70 min 時(shí)13%A～18%A，70～73 min 時(shí)18%A～3%A，73～88 min 時(shí)3%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm。

2.2.2 溶液制備

取芍藥苷、阿魏酸、甘草苷對(duì)照品各適量，精密稱定，置同一容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含芍藥苷310.00 μg、阿魏酸56.00 μg、甘草苷66.67 μg 的混合對(duì)照品溶液。取定眩飲顆粒及不含白芍、當(dāng)歸、川芎、羌活和甘草的陰性樣品各1.0 g，精密稱定，置容量瓶中，精密加入60%甲醇5 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

1.芍藥苷 2.阿魏酸 3.甘草苷A.陰性對(duì)照品溶液 B.混合對(duì)照品溶液 C.供試品溶液圖2 高效液相色譜圖1.Paeoniflorin 2.Ferulic acid 3.LiquiritinA.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果混合對(duì)照品溶液和供試品溶液中，芍藥苷、阿魏酸、甘草苷的分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。詳見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，4，8，10，14，18 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 定眩飲顆粒中3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test of three components in Dingxuanyin Granules（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、阿魏酸、甘草苷峰面積的RSD分別為0.04%，0.10%，0.11%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20211201）適量，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制樣后0，4，8，12，16，20，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、阿魏酸、甘草苷峰面積的RSD分別為0.61%，0.91%，0.80%（n=7），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20211202）樣品6份，每份1.0 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果芍藥苷、阿魏酸、甘草苷的平均含量分別為0.85，0.08，0.25 mg/g，RSD分別為3.36%，2.56%，2.89%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20211203）6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入一定質(zhì)量濃度的待測(cè)成分，作為對(duì)照品溶液，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 定眩飲顆粒中3種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of three components in Dingxuanyin Granules（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20211201，20211202，20211203）樣品各1.0 g，精密稱定，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 定眩飲顆粒中3種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of three components in Dingxuanyin Granules（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 TLC 鑒別

熟地黃的TLC 鑒別中，以2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》熟地黃項(xiàng)下供試品制備方法制備，但TLC 圖分離度較差；參考文獻(xiàn)［5］中熟地黃制備方法，加水后加熱使樣品溶散，升溫至沸騰，取上清液，冷卻后加乙酸乙酯提取3次，揮干，加甲醇溶解，以二甲苯-乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開(kāi)劑展開(kāi)，以2，4-二硝基苯肼乙醇顯色，效果更佳，斑點(diǎn)更清晰。

炙甘草的TLC鑒別中，參考2020年版《中國(guó)藥典（一部）》，將供試品溶液點(diǎn)在1%NaOH 處理的硅膠G板，但斑點(diǎn)模糊且不均勻，分離度差。本研究中將供試品溶液直接點(diǎn)于硅膠G板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開(kāi)劑展開(kāi)，以10%硫酸乙醇顯色，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm波長(zhǎng)）下檢視，斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果較好。

以2020年版《中國(guó)藥典（一部）》姜半夏項(xiàng)下方法進(jìn)行TLC 鑒別，可能由于定眩飲顆粒中姜半夏處方量較低，且有其他成分干擾，故干姜斑點(diǎn)有明顯干擾，最終未將姜半夏納入定眩飲顆粒的TLC 鑒別中。參考川芎藥材項(xiàng)下方法進(jìn)行TLC 鑒別，顯示陰性對(duì)照有干擾，最終未將川芎納入TLC鑒別中。

3.2 HPLC 法測(cè)定含量

定眩飲方中，熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎共為君藥，麥冬、山藥共為臣藥，天麻、薄荷、羌活合為佐藥；姜半夏、甘草、砂仁合為使藥。諸藥共用，合奏疏風(fēng)定眩、補(bǔ)血益精之功效。選擇指標(biāo)性成分時(shí)，考慮白芍作為處方中的君藥，主要化學(xué)物質(zhì)為白芍總苷，而芍藥苷又是白芍總苷中研究較多的主要活性成分，能發(fā)揮鎮(zhèn)痛、保肝、促進(jìn)造血功能、抗血栓、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［6-8］；阿魏酸作為君藥當(dāng)歸、川芎和佐藥羌活中的共有活性成分，具有抗血小板凝集、抗血栓、抗菌、消炎、增強(qiáng)免疫力等功效［9-14］；甘草苷是重要的黃酮類化合物，具有解痙、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、神經(jīng)保護(hù)等作用［15-17］。故本研究中測(cè)定了定眩飲顆粒中芍藥苷、阿魏酸和甘草苷3 種成分的含量，以更好地控制其質(zhì)量。在含量測(cè)定方法的建立過(guò)程中，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描，顯示245 nm 波長(zhǎng)下3個(gè)色譜峰峰形最好，故選擇245 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)；在樣品制備中，分別考察了50%，60%，70%，80%甲醇為溶劑時(shí)樣品中3種成分的含量，結(jié)果顯示，以60%甲醇為溶劑時(shí)3種成分色譜峰峰面積最高；流動(dòng)相分別考察了水-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈、0.1%醋酸水溶液-乙腈和0.1%醋酸水溶液-甲醇對(duì)各色譜峰峰形及分離度的影響，結(jié)果以0.1%醋酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，3個(gè)成分的色譜峰峰形和分離度均較好。

3.3 方法評(píng)價(jià)

所建立的定性、定量方法簡(jiǎn)便易行、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可用于定眩飲顆粒的質(zhì)量控制。