中成藥中沙門氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用*

馮潤東，賈首前，王莉芳，楊曉莉，徐長根△，張鴻豪

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065；3.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

沙門氏菌Salmonella為常見人畜共感染的革蘭陰性桿菌［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因沙門氏菌感染而發(fā)病的人口達(dá)9 000萬，死亡15.5 萬［2］。沙門氏菌在自然界分布廣泛，且可在動(dòng)植物體內(nèi)定植，而中成藥大多由動(dòng)植物加工炮制而成，且在大量丸散膏丹的方劑中常以原粉入藥，故中成藥中沙門氏菌的監(jiān)測(cè)是藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。沙門氏菌的檢驗(yàn)方法主要包括生理生化法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法［3］。2020 年版《中國藥典》中，沙門氏菌的檢測(cè)仍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法［4］，操作簡單、成本低，但操作過程及檢測(cè)周期長，在快速、特異檢測(cè)方面具有一定局限性［5-6］。其他各種檢測(cè)方法靈敏、迅速，但需昂貴、龐大的儀器設(shè)備和復(fù)雜煩瑣的電泳過程等，在藥品檢測(cè)中的應(yīng)用較少。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）為一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)［7］，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，利用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶，在等溫條件下連續(xù)擴(kuò)增，試驗(yàn)過程快速、簡便，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高，已被廣泛應(yīng)用于致病微生物的檢測(cè)，有關(guān)沙門氏菌的檢測(cè)方法也有研究。歐新華等［8］建立了基于LAMP 技術(shù)的沙門氏菌屬檢測(cè)方法，并經(jīng)電泳法評(píng)價(jià)其效果。劉衛(wèi)德等［9］建立了檢測(cè)中成藥中沙門氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法。雖然采用的檢測(cè)方法多樣，但檢測(cè)效果不一，尤其是涉及中成藥中沙門氏菌LAMP檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用報(bào)道較少。為探索分子生物學(xué)方法在中成藥沙門氏菌檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，本研究中基于LAMP 技術(shù)原理，以沙門氏菌4 個(gè)亞種毒理因子invA 基因作為檢測(cè)模板，并設(shè)計(jì)特異性引物，建立簡便、高效的中成藥沙門氏菌的特異性檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)藥品中的沙門氏菌提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

ZHTY-50ES型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；202-2A 型恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；Eppendorf Mini Spain 型離心機(jī)（德國艾本德股份公司）；StepOne Plus 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；MBE200A 型藍(lán)光切膠儀（蘇州宇恒生物科技有限公司）。

1.2 試藥

Bst DNA 聚合酶（批號(hào)為B110061），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/L，批號(hào)為B500056），均購自生工生物工程＜上海＞股份有限公司；MgSO4（100 mmol/L），50×LAMP 熒光染料，亞硒酸鹽煌綠增菌液，生化試劑，均購于西安晶博生物科技有限公司；9 批次待檢藥品均為市售，藥品信息見表1。

表1 待檢藥品信息Tab.1 Information of drugs to be detected

1.3 菌株

沙門氏菌屬：甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiA，乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiB，丙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiC，鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium，金黃色葡萄球菌Staphylo-coccus aureus，大腸桿菌Escherichia coli，產(chǎn)志賀氏毒素大腸埃希氏菌Shiga toxin-producingEscherichia coli（STEC），均購自北納生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 LAMP 引物設(shè)計(jì)及合成

選擇沙門氏菌invA 基因，根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中提供的沙門氏菌特異基因組序列進(jìn)行序列比對(duì)，尋找一段高度保守區(qū)作為擴(kuò)增對(duì)象，通過Primer Exploer V5軟件設(shè)計(jì)3 組LAMP 引物，分別為正向外引物（F3）、反向外引物（B3），正向內(nèi)引物（FIP）、反向內(nèi)引物（BIP），正向環(huán)引物（LF）、反向環(huán)引物（LB）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 沙門氏菌invA基因的LAMP檢測(cè)用引物序列Tab.2 Primer sequences for LAMP detection of invA gene of Salmonella

2.2 細(xì)菌DNA 模板制備

取細(xì)菌培養(yǎng)物1 mL，置1.5 mL EP管中，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集菌液，棄上清液。加入100 μL DNA 提取液，混勻，金屬浴100 ℃加熱保溫10 min，以12 000 r/ min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一EP管中，作為DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物篩選

將上述合成的LAMP 引物按濃度比例F3-B3-LF-LB-FIP-BIP（1∶1∶2∶2∶4∶4）進(jìn)行配制。以沙門氏菌基因組DNA 為模板，采用以下LAMP 反應(yīng)體系及檢測(cè)條件進(jìn)行擴(kuò)增，篩選最佳引物組。

LAMP反應(yīng)體系［10］（10μL）：取ddH2O2.8μL，LAMP緩沖液1μL，dNTPs（1.6 mmol/ L）1.4 μL，MgSO4（8 mmol/ L）0.6 μL，甜菜堿（1 mol/ L）2 μL，Bst DNA 酶（8 U/ μL）0.4 μL，染料（1.6 mmol/ L）0.4 μL，引物（10 μmol/ L）0.4 μL，制備預(yù)混合溶液。每個(gè)反應(yīng)管加入9 μL 預(yù)混合溶液，再加入1 μL 供試品溶液及對(duì)照品溶液，并設(shè)空白對(duì)照。后續(xù)試驗(yàn)溶液的配制同此。

LAMP 檢測(cè)條件：反應(yīng)混合物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行LAMP 反應(yīng)，反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。試驗(yàn)結(jié)果以擴(kuò)增曲線、產(chǎn)物電泳或在藍(lán)光切膠儀下以陽性和陰性對(duì)照為基準(zhǔn)目測(cè)進(jìn)行判定。

最優(yōu)引物篩選：分別用3 組引物進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物在藍(lán)光切膠儀下以陽性和陰性對(duì)照為基準(zhǔn)進(jìn)行目測(cè)（圖1 A），結(jié)果陽性反應(yīng)液為黃色，陰性反應(yīng)液為橙色，該反應(yīng)結(jié)果基于擴(kuò)增反應(yīng)的微量pH 變化進(jìn)行檢測(cè)［10］。由反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖（圖1 B）可見，陽性對(duì)照泳道中出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而陰性對(duì)照泳道中無條帶，表明invA 基因引物組2為最優(yōu)引物。

M.Marker 1.陽性對(duì)照 2-8.陰性對(duì)照A.藍(lán)光燈下結(jié)果 B.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖1 invA基因引物組LAMP擴(kuò)增特異性評(píng)價(jià)M.Marker 1.Positive control 2-8.Negative controlA.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.1 Evaluation of LAMP amplification specificity of invA gene primer groups

2.4 方法學(xué)考察

特異性試驗(yàn)：為了驗(yàn)證引物對(duì)沙門氏菌檢測(cè)的特異性，于37 ℃條件下培養(yǎng)后，用2.3 項(xiàng)下反應(yīng)體系及檢測(cè)條件，以4株陽性對(duì)照沙門氏菌、3株非沙門氏菌細(xì)菌培養(yǎng)物獲得的DNA 為模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)，以不含DNA 模板的陰性質(zhì)控品作為陰性對(duì)照，驗(yàn)證引物特異性，重復(fù)試驗(yàn)3 次。采用建立的沙門氏菌LAMP 檢測(cè)方法對(duì)7株細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，菌株來源見表3，特異性檢測(cè)結(jié)果見圖2。反應(yīng)產(chǎn)物在藍(lán)光切膠儀下以陽性和陰性對(duì)照為基準(zhǔn)進(jìn)行目測(cè)，結(jié)果見圖2 A。可見，沙門氏菌屬的檢測(cè)結(jié)果中，陽性反應(yīng)液為黃色（4 株沙門氏菌亞種均為陽性），陰性及空白對(duì)照反應(yīng)液為橙色。由圖2 B 可見，1，2，3，4泳道中均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，而5，6，7及無菌水（空白對(duì)照）泳道中均無擴(kuò)增條帶，表明invA 基因引物特異性較好。

表3 試驗(yàn)菌株來源Tab.3 Sources of test strains

1.甲型副傷寒沙門氏菌 2.乙型副傷寒沙門氏菌 3.丙型副傷寒沙門氏菌 4.鼠傷寒沙門氏菌 5.大腸桿菌 6.金黃色葡萄球菌 7.產(chǎn)志賀氏毒素大腸埃希氏菌 8.無菌水（空白對(duì)照）A.藍(lán)光燈下結(jié)果 B.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2 沙門氏菌LAMP特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果1.Salmonella paratyphi A 2. Salmonella paratyphi B 3. Salmonella paratyphi C 4.Salmonella typhimurium 5.Escherichia coli 6.Staphylococcus aureus 7.Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）8.Sterile water（blank control）A.Results visualized with blue lamp B.Results of agarose gel electrophoresisFig.2 Results of LAMP specificity test of Salmonella

靈敏度試驗(yàn)：取營養(yǎng)瓊脂平板上新鮮生長的沙門氏菌BNCC336664 單菌落接種于LB 肉湯中，以180 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，37 ℃培養(yǎng)24 h后，吸取1 mL 菌懸液置9 mL 無菌生理鹽水中，依次稀釋，分別得濃度為101，102，103，104，105，106，107cfu/ mL 的7 份純菌稀釋液樣品。分別取上述7 份樣品制備對(duì)應(yīng)的DNA 模板1 μL，采用2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行LAMP反應(yīng)，每份樣品DNA 模板設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。沙門氏菌原菌液濃度為108cfu/mL，10 倍倍比稀釋后，模板量分別為3×107～3×100cfu/mL，陰性對(duì)照為超純水，對(duì)系列稀釋菌液進(jìn)行LAMP 檢測(cè)。結(jié)果見圖3。可見，沙門氏菌以invA 基因引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增的檢測(cè)靈敏度可達(dá)3×101cfu/mL。

1.超純水（陰性對(duì)照）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mL圖3 沙門氏菌LAMP靈敏度試驗(yàn)結(jié)果1.Ultra-pure water（negative control）2.107 cfu/mL 3.106 cfu/mL 4.105 cfu/mL 5.104 cfu/mL 6.103 cfu/mL 7.102 cfu/mL 8.101 cfu/mL 9.100 cfu/mLFig.3 Results of LAMP sensitivity test of Salmonella

基質(zhì)檢測(cè)限確定：取亞硒酸鹽煌綠增菌液10 mL，置25 mL EP 管中，分別 按107，106，105，104，103，102，101cfu/mL 的濃度加入沙門氏菌液，混勻，以不含菌液的陰性增菌液作為陰性對(duì)照，分別取1 mL 菌液提取DNA，進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增檢測(cè)。本研究中所建立的LAMP檢測(cè)限為100 cfu/ mL，檢測(cè)微量污染沙門氏菌的樣品需通過增菌達(dá)到更高的靈敏度。對(duì)細(xì)菌濃度為3×107，3×106，3×105，3×104，3×103，3×102，3×101cfu/mL的模擬增菌液樣本進(jìn)行LAMP 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖4。可見，在細(xì)菌濃度為3×102cfu/mL 時(shí)仍可擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。

2.5 樣品檢測(cè)

2-7.模板量為3×107～3×102 cfu/mL圖4 基質(zhì)中沙門氏菌LAMP檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果2-7.Templates：3×107-3×102 cfu/mLFig.4 Results of limit of detection determination of LAMP of Salmonella in matrix

取1.2 項(xiàng)下待測(cè)藥品各10 g 或10 mL，置無菌錐形瓶中，加亞硒酸鹽煌綠增菌液至200 mL，作為供試品溶液；另加入1 mL低于103cfu/mL的沙門氏菌液，同法制備供試液，作為陽性對(duì)照溶液；于無菌錐形瓶中加入亞硒酸鹽煌綠增菌液至200 mL，作為陰性對(duì)照溶液。上述溶液分別置37 ℃、180 r/ min 恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12 h后，按2.2 項(xiàng)下方法提取基因組DNA，采用建立的LAMP 方法進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。可見，陽性對(duì)照溶液泳道有特異性擴(kuò)增，所有供試品溶液和陰性對(duì)照溶液泳道均無特異性擴(kuò)增，說明9批次樣品均未污染沙門氏菌。

M.Marker DL 2000 N，N'.陰性對(duì)照溶液 P.陽性對(duì)照溶液1.排毒養(yǎng)顏膠囊 2.川貝枇杷露 3.川貝枇杷膏 4.強(qiáng)力枇杷露 5-8.桑菊感冒片 9.黃連上清丸圖5 9批次中成藥沙門氏菌LAMP檢測(cè)結(jié)果M.Marker DL 2000 N，N'.Negative control P.Positive control 1.Paidu Yangyan Capsules 2.Chuanbei Pipa Syrup 3.Chuanbei Pipa Concentrated Decoction 4.Qiangli Pipa Syrup 5-8.Sangju Cold Tablets 9.Huanglian Shangqing PillsFig.5 Results of Salmonella detection by LAMP in nine batches of Chinese patent medicine

3 討論

基因的篩選是沙門氏菌檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，invA 基因具有屬特異性，是沙門氏菌屬檢測(cè)的常用靶基因［11-12］。經(jīng)生物信息學(xué)分析與綜合測(cè)試評(píng)估，invA 在沙門氏菌中的特異性能為97.6%～97.8%［13-14］，達(dá)到理想靶標(biāo)檢測(cè)要求，故本研究中選用invA 基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)。

LAMP 檢測(cè)對(duì)于引物設(shè)計(jì)的要求較高，反應(yīng)所需Bst DNA 聚合酶可在特定條件下將寡核苷酸隨機(jī)摻入有缺口的DNA 模板進(jìn)行跨片段擴(kuò)增［15］。另外，環(huán)引物的加入可加速LAMP 試驗(yàn)［16］，但同時(shí)也增加了引物二聚體形成非特異性擴(kuò)增的可能性，故引物設(shè)計(jì)不合理易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。本研究中設(shè)計(jì)了3組沙門氏菌invA特異性基因，每組篩選6條引物，引物特異性良好，試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

本研究中以甲型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiA、乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiB、丙型副傷寒沙門氏菌Salmonella paratyphiC、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium的invA 基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，經(jīng)過引物設(shè)計(jì)、引物篩選、引物特異性試驗(yàn)、靈敏度檢測(cè)、基質(zhì)中檢測(cè)限測(cè)試及前增菌培養(yǎng)，成功構(gòu)建了中成藥中4 個(gè)亞種沙門氏菌的LAMP 快速檢測(cè)方法，其最佳反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min，方法靈敏度可達(dá)101cfu/mL。采用新建立的LAMP 方法測(cè)定了模擬樣本亞硒酸鹽煌綠增菌液中的沙門氏菌，其靈敏度與細(xì)菌直接提取DNA 進(jìn)行LAMP 測(cè)定結(jié)果相同，且干擾較小。本試驗(yàn)根據(jù)擴(kuò)增曲線、產(chǎn)物電泳及熒光檢測(cè)判定LAMP 檢測(cè)結(jié)果，證明LAMP 快速檢測(cè)方法檢測(cè)沙門氏菌的特異性和靈敏度較好，4 株沙門氏菌擴(kuò)增結(jié)果顯示均為陽性，其余3 種對(duì)照細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果顯示均為陰性。本方法從DNA 提取開始，約1.5 h 即可完成試驗(yàn)，大大減少了檢測(cè)周期。其擴(kuò)增反應(yīng)在65 ℃恒溫條件下即可完成，不需使用特殊的儀器設(shè)備，操作簡便，LAMP 技術(shù)在普通實(shí)驗(yàn)室條件下即可實(shí)現(xiàn)［17］。采用LAMP 方法快速初檢后，初篩呈陽性的樣本再用常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行驗(yàn)證，可縮短檢測(cè)周期，減少了工作量，有效降低了檢測(cè)成本。

本研究中建立的LAMP 快速檢測(cè)方法能在24 h 內(nèi)完成中成藥中沙門氏菌的檢測(cè)，具有檢測(cè)時(shí)效短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、不易交叉污染等優(yōu)勢(shì)，成為《中國藥典》方法的有效補(bǔ)充。此外，本研究中建立的方法經(jīng)適當(dāng)調(diào)整后還可應(yīng)用于中藥材、中藥飲片、保健食品等原料中沙門氏菌污染的監(jiān)測(cè)工作，有較好的推廣應(yīng)用前景。