土大黃根提取物對(duì)銀屑病模型小鼠血清代謝組學(xué)指標(biāo)的影響*

巴合沙拉·馬乃甫，尤力都孜·買(mǎi)買(mǎi)提，玉素甫江·艾力，阿布都帕塔爾·阿布迪熱扎克，熱比姑麗·伊斯拉木△

（1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000）

土大黃是蓼科酸模屬RumexL.植物，產(chǎn)于新疆各地。民間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，維吾爾族常用土大黃根、莖和全草水煎煮液治療銀屑病等各種皮膚病，且療效較好。本課題組分別用小鼠尾部鱗片角化不全模型、雌鼠陰道上皮模型［1］、普萘洛爾誘導(dǎo)耳部角化模型［2］、咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠模型［3-4］等銀屑病樣模型開(kāi)展土大黃治療銀屑病的藥理學(xué)研究，以驗(yàn)證民間用藥的合理性和科學(xué)性。本研究中以土大黃干預(yù)銀屑病角化異常的傳統(tǒng)天然模型（小鼠尾部鱗片角化不全模型），從小鼠血清代謝組學(xué)、尾部皮膚組織病理學(xué)角度探討了土大黃根治療銀屑病的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)及利用維吾爾民間藥材土大黃奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：DW-86L338J 型海爾超低溫冰箱（海爾集團(tuán)公司）；5415D 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 股份公司）；Inova 600 兆超導(dǎo)核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司），配有核磁共振波譜儀工作站；LEICA TP1020 型生物組織脫水機(jī)，LEICA RM2235 型切片機(jī)，LEICA DM4000型生物顯微鏡，LEICA LAS V4.5版顯微成像系統(tǒng)，均購(gòu)自德國(guó)萊卡公司；KD-BMⅢ型生物組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）。

試藥：土大黃根（新疆華安中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)為12110），經(jīng)新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾巴依·阿不都沙力克教授鑒定為正品；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020822，批號(hào)為140670）；消銀顆粒（陜西康惠制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000019，批號(hào)為130809）；異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉［新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，木尼孜其白里海密，維吾爾語(yǔ)命名為Munziq Balgam（MB），批準(zhǔn)文號(hào)M20052633］；重水（D2O，Cambridage Isotop Laboratories，Inc.）。

動(dòng)物：KM 小鼠80只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（新）2011-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（新）2011-0005。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前檢疫2 d，觀察一般狀況，最終選用符合要求的70只小鼠用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所藥物安全性評(píng)價(jià)中心審核，均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的管理準(zhǔn)則。

1.2 方法

土大黃根提取物制備［1-5］：稱(chēng)取適量土大黃根，加8 倍量70%乙醇溶液室溫密閉浸泡1 h，回流提取3次，每次1.5～2.0 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，真空干燥，得干膏粉。

小鼠給藥劑量計(jì)算［2-8］：消銀顆粒臨床服用量為0.175 g/（kg·d），根據(jù)人與實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量比例計(jì)算，本研究中的用量與臨床等效劑量相當(dāng)，設(shè)定為1.577 g/（kg·d）。同公式換算得地塞米松的臨床等效量為1.05 mg/（kg·d），異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉的臨床等效量為2 g/（kg·d）［6］。土大黃根提取物用藥劑量根據(jù)小鼠單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)和大鼠反復(fù)給藥毒性實(shí)驗(yàn)的有效劑量設(shè)置為1，2，4 g/kg（低、中、高劑量）［7-8］。

建模、分組與給藥：小鼠尾部鱗片角化不全模型［9-10］于20 世紀(jì)70 年代初被應(yīng)用于探討藥物抗銀屑病樣作用。正常情況下，小鼠尾部鱗片的表皮角質(zhì)層角質(zhì)形成細(xì)胞保留有細(xì)胞核，而顆粒層細(xì)胞缺失，其天然的角化形式與人類(lèi)銀屑病表皮相似，可模擬銀屑病角化不全的特點(diǎn)，故可作為銀屑病角化異常的傳統(tǒng)天然模型。將70 只KM 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對(duì)照組（CON 組），化學(xué)藥陽(yáng)性對(duì)照組（DXM組，1.05 mg/ kg醋酸地塞米松片），中藥制劑陽(yáng)性對(duì)照組（XYKL組，1.577 g/ kg 消銀顆粒），維吾爾醫(yī)藥陽(yáng)性對(duì)照組（MB組，2 g/kg 異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉），土大黃根提取物低、中、高劑量組（RE-L 組、RE-M 組、RE-H組，1，2，4 g/kg），各10只。CON 組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉（0.5%CMC-Na），其余各組小鼠以每10 g體質(zhì)量灌胃0.2 mL相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)15 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察小鼠一般狀況，每周測(cè)1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

樣品收集與處理：末次給藥2 h后，采用摘眼球法取血，4 ℃離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/ min）10 min，分離血清，保存于-80 ℃低溫冰箱。測(cè)試時(shí)室溫解凍，取血樣200 μL，加400 μL 磷酸鹽生理鹽水緩沖液，混勻，放置10 min，低溫高速離心機(jī)離心（轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，離心半徑為5 cm）10 min，取上清液550 μL，置5 mm 核磁管內(nèi)，取鼠尾距離根部3 cm 皮膚標(biāo)本，用15%甲醛水溶液固定、脫水、石蠟包埋，并用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察尾部皮膚組織病理學(xué)變化。

核磁共振氫譜測(cè)試：將裝有血樣的5 mm核磁管置核磁共振儀進(jìn)行1H-NMR譜測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)均在Inova 600兆核磁共振波譜儀上用ID探頭以弛豫編輯（CPMG）脈沖序RD-90°-τ-180°-2τ-180°-2τ-180°-…-ACQ進(jìn)行。設(shè)置參數(shù)1H 核磁共振頻率599.15 MHz，掃描累積128次，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)32 768，譜寬20×10-6，采樣延遲2 min，采樣時(shí)間（AQ）1.64 min，測(cè)試溫度25 ℃，采用預(yù)飽和方法壓制水峰。為了解譜工作的順利進(jìn)行，選取質(zhì)量較高的1H-NMR 譜樣品進(jìn)行二維核磁共振圖譜測(cè)試，包括1H-1H 同核相關(guān)譜（1H-1H COSY）、質(zhì)子全相關(guān)譜（TOCSY）和J-分解譜（J-RES）等，用于譜圖中各峰的指認(rèn)，以便鑒定代謝成分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

受原始1H-NMR 圖譜數(shù)據(jù)量龐大、數(shù)據(jù)點(diǎn)具有高度相關(guān)性、溶劑峰等因素影響，需對(duì)1H-NMR 圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。本研究中血樣1H-NMR 圖譜數(shù)據(jù)采用0.3 Hz 線寬的指數(shù)窗函數(shù)，先進(jìn)行傅里葉變換后進(jìn)行基線及相位調(diào)整。血清圖譜以α-葡萄糖δ5.233×10-6質(zhì)子信號(hào)作為參考定標(biāo)，在δ9.0～0.5 范圍內(nèi)對(duì)每段δ0.003 積分段自動(dòng)積分。同時(shí)，排除血清1H-NMR 譜水信號(hào)范圍為δ5.22～4.66的積分?jǐn)?shù)據(jù)，對(duì)剩余積分值進(jìn)行歸一化處理。積分值導(dǎo)入Microsoft Excel軟件，采用SIMCA-P+11.0 軟件包進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），根據(jù)所得代謝物相關(guān)系數(shù)確定對(duì)照組與給藥組的差異性代謝成分，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以R2X，R2Y，Q2為所建模型的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究中通過(guò)Pearson 相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的r與R的臨界值確定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的代謝產(chǎn)物臨界值。

2 結(jié)果

2.1 OPLS-DA 模式分析

利用OPLS-DA 建立模型的方法評(píng)估各組小鼠的代謝物差異，結(jié)果顯示，CON 組與各給藥組間均有一定分離趨勢(shì)，小鼠尾部鱗片角化不全模型的區(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度均可達(dá)到要求，CON 組與DXM 組、XYKL 組、MB組、RE-L組、RE-M組、RE-H組的模型預(yù)測(cè)參數(shù)見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，醋酸地塞米松，消銀顆粒，異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉，低、中、高劑量土大黃根提取物對(duì)尾部鱗片角化不全模型小鼠均有一定治療作用。

2.2 血清標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)與鑒定

2.2.1 CON 組與各陽(yáng)性對(duì)照藥組血清差異性代謝物組分

注：模型預(yù)測(cè)參數(shù)分別為R2X=0.40，R2Y=0.87，Q2=0.71；R2X=0.36，R2Y=0.81，Q2=0.51；R2X=0.37，R2Y=0.91，Q2=0.71；R2X=0.27，R2Y=0.94，Q2=0.76；R2X=0.33，R2Y=0.96，Q2=0.85；R2X=0.22，R2Y=0.95，Q2=0.80。圖1 各組小鼠血清OPLS-DA得分圖Note：Predictive parameters of the model are as follows：R2 X=0.40，R2 Y=0.87 and Q2=0.71；R2 X=0.36，R2 Y=0.81 and Q2=0.51；R2 X=0.37，R2 Y=0.91 and Q2=0.71；R2 X=0.27，R2 Y=0.94 and Q2=0.76；R2 X=0.33，R2 Y=0.96 and Q2=0.85；R2 X=0.22，R2 Y=0.95 and Q2=0.80.Fig.1 Scoring plot of OPLS-DA of serum in each group

通過(guò)數(shù)據(jù)分析，CON 組與DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠血清中共發(fā)現(xiàn)23 種差異性代謝物，詳見(jiàn)表1。與CON 組比較，DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠血清丙氨酸、甘氨酸、乳酸水平均顯著升高，不飽和脂類(lèi)、低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）水平均顯著降低（P＜0.05）；DXM 組、XYKL 組小鼠血清亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、膽堿、蛋氨酸、乙酸、苯丙氨酸水平均顯著升高（P＜0.05）；DXM 組小鼠血清肌醇、鯊肌醇、乙酰半胱氨酸、檸檬酸水平均顯著升高，糖蛋白和丙酮水平均顯著降低（P＜0.05）；XYKL組小鼠血清瓜氨酸和肌酸水平均顯著升高（P＜0.05）；MB 組小鼠血清肌醇和丙酮水平均顯著降低，肌酸水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 模型對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清主要差異性代謝物及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Main differential metabolites and correlation coefficients in serum in the CON group and the positive control groups

2.2.2 CON 組與土大黃根提取物組血清差異性代謝物組分

通過(guò)數(shù)據(jù)分析，CON 組與RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組小鼠血清中共發(fā)現(xiàn)13 種差異性代謝物，詳見(jiàn)表2。與CON組比較，RE-L組、RE-M組、RE-H 組小鼠血清丙氨酸、乳酸、甘氨酸、膽堿、肌酸水平均顯著升高，LDL和VLDL水平均顯著降低（P＜0.05）；RE-M 組、RE-H 組小鼠血清α-葡萄糖和β-葡萄糖水平均顯著升高，糖蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；RE-H 組小鼠血清不飽和脂類(lèi)和苯丙氨酸水平均顯著升高，丙酮水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 模型對(duì)照組與土大黃根提取物組小鼠血清主要差異性代謝物及相關(guān)系數(shù)Tab.2 Main differential metabolites and correlation coefficients in serum in the CON group and the RE groups

2.3 皮膚組織病理學(xué)變化

CON 組小鼠皮膚完全角化，顆粒層變薄或缺乏。與CON 組比較，DXM 組、XYKL 組、MB 組小鼠均出現(xiàn)不同程度的顆粒細(xì)胞層增厚或促進(jìn)形成顆粒細(xì)胞層，相互間略有差異，但不顯著；RE-L組、RE-M組、RE-H組小鼠也均出現(xiàn)不同程度的顆粒細(xì)胞層增厚或促進(jìn)顆粒細(xì)胞層形成，且呈劑量規(guī)律性。與DXM組、XYKL組、MB組比較，RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組小鼠尾部皮膚組織病理學(xué)變化略有差異，但不顯著。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組尾部鱗片角化不全模型小鼠皮膚組織病理變化（HE染色，×40，n=10）Fig.2 Histopathological changes of skin of mouse tail model in each group（HE staining，×40，n=10）

3 討論

銀屑病為常見(jiàn)慢性復(fù)發(fā)性炎性皮膚病，全球發(fā)病率為2%～3%，歐洲南部國(guó)家發(fā)病率為8%～11%［11］。近年來(lái)，銀屑病與代謝綜合征的相關(guān)性成為皮膚病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，代謝組學(xué)技術(shù)為證候本質(zhì)的研究提供了強(qiáng)有力的手段［12-17］。文獻(xiàn)［18-22］報(bào)道，代謝組學(xué)用于新藥篩選、作用機(jī)制、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療等的研究。動(dòng)物模型是研究人類(lèi)疾病病因、發(fā)病機(jī)制、治療方法的一種重要工具，其中銀屑病罕見(jiàn)于任何非人類(lèi)動(dòng)物，且自然出現(xiàn)的病例極少見(jiàn)，不適于進(jìn)行科學(xué)研究。因此，建立銀屑病動(dòng)物模型顯得尤為必要［23］。作為研究銀屑病的可用模型，應(yīng)具備相應(yīng)的組織病理學(xué)特征、類(lèi)似發(fā)病機(jī)制、對(duì)抗治療藥物的相似反應(yīng)。其中，小鼠尾部鱗片角化不全模型操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)易得，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)，并普遍使用。本研究中利用銀屑病角化異常的傳統(tǒng)天然模型（小鼠尾部鱗片角化不全模型），經(jīng)血清代謝組學(xué)、皮膚組織病理學(xué)檢查，初步探討了土大黃根提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性銀屑病的作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，灌胃給藥15 d后，對(duì)模型小鼠血清化學(xué)成分的影響，DXM 組、XYKL 組、MB 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）、乳酸，下調(diào)血清不飽和脂類(lèi)、脂類(lèi)（LDL 和VLDL）；DXM 組、XYKL 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸）、膽堿、乙酸；DXM組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清肌醇、鯊肌醇、乙酰半胱氨酸、檸檬酸，下調(diào)血清糖蛋白和丙酮；XYKL 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清瓜氨酸和肌酸；MB 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清肌酸，下調(diào)肌醇和丙酮。結(jié)果表明，地塞米松、消銀顆粒、異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉對(duì)模型小鼠血清化學(xué)成分的影響主要表現(xiàn)在上調(diào)血清氨基酸和乳酸，下調(diào)不飽和脂類(lèi)、脂類(lèi)（LDL和VLDL）水平而起作用，尤其是對(duì)血清丙氨酸、甘氨酸影響普遍。提示DXM組、XYKL組、MB組抗銀屑病作用代謝標(biāo)記物主要為丙氨酸、甘氨酸、乳酸、不飽和脂類(lèi)、脂類(lèi)（LDL和VLDL），這與文獻(xiàn)［12-17］報(bào)道結(jié)論相似，但不同的陽(yáng)性對(duì)照藥物代謝產(chǎn)物不同。

研究結(jié)果顯示，灌胃給藥15 d后，對(duì)模型小鼠血清化學(xué)成分的影響，RE-L 組、RE-M 組、RE-H 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清氨基酸（丙氨酸、甘氨酸）、肌酸、乳酸、膽堿，下調(diào)血清脂類(lèi)（LDL和VLDL）；RE-M組、RE-H組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清α-葡萄糖和β-葡萄糖，下調(diào)血清糖蛋白；RE-H 組主要表現(xiàn)為上調(diào)血清不飽和脂類(lèi)和苯丙氨酸，下調(diào)血清丙酮。結(jié)果表明，土大黃根提取物對(duì)模型小鼠血清化學(xué)成分的影響主要表現(xiàn)在上調(diào)血清氨基酸和下調(diào)血清脂類(lèi)（LDL 和VLDL）而起作用。提示土大黃根提取物（1，2，4 g/kg）抗銀屑病作用代謝標(biāo)記物主要為丙氨酸、甘氨酸、肌酸、乳酸、膽堿、脂類(lèi)（LDL 和VLDL），這與文獻(xiàn)［12-17］報(bào)道結(jié)論相似，但不同劑量土大黃根提取物的代謝產(chǎn)物不同。

研究結(jié)果顯示，灌胃給藥15 d后，HE 染色結(jié)果表明，CON 組小鼠皮膚完全角化，顆粒層變薄或缺乏；與CON組比較，DXM組、XYKL組、MB組、RE-L組、RE-M組、RE-H 組均可出現(xiàn)不同程度的顆粒細(xì)胞層增厚或促進(jìn)顆粒細(xì)胞層形成。提示陽(yáng)性對(duì)照藥物和土大黃根提取物均能改變其天然的角化形式與人類(lèi)銀屑病表皮相似的小鼠尾部鱗片角化不全模型，具有治療銀屑病的作用。

綜上所述，地塞米松、消銀顆粒、異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉和土大黃根提取物均能調(diào)節(jié)尾部鱗片角化不全模型小鼠血清氨基酸及小分子物質(zhì)代謝紊亂，升高血清丙氨酸、甘氨酸、乳酸水平，降低血清脂類(lèi)（LDL和VLDL）水平，改善該模型小鼠的皮膚完全角化、顆粒層變薄或缺乏，達(dá)到治療銀屑病的作用。不同藥物對(duì)其模型的影響有差異，其中地塞米松臨床作用最強(qiáng)烈、血清差異性代謝物最多；其次為消銀顆粒、異常黏液質(zhì)成熟劑浸膏粉、土大黃根提取物，但其優(yōu)勢(shì)、實(shí)際作用價(jià)值有待深入研究。