一種鹿茸復方乳液抗皮膚衰老的實驗研究

郁兵，王波，何鳳琴

作者單位：1西安文理學院生物與環境工程學院基因工程重點實驗室，陜西 西安710065；2西安市秦嶺天然產物開發與抗癌類創新藥物研究重點實驗室，陜西 西安710065

人的皮膚組織在20～25歲以后就會出現衰老現象，體現為干燥、松弛、皺紋、暗沉，然而隨著社會的發展，人類對肌膚之美的追求日趨強烈。研究表明，一些具有生物活性的天然產物可以有效護膚、美白、抗衰老，這些成分主要來源于植物、動物和微生物，其中一些植物成分的分子細小，容易被皮膚吸收，還具有長期使用無副作用或副作用小的優點［1-2］，已在護膚品領域得到了廣泛應用，而動物成分在抗衰老護膚領域的研究和應用還比較少，和植物藥材相比，動物藥材成分往往更為復雜，與人類組織具有較為相似的組化成分，這些因素有可能致使動物藥在護膚領域具有更為廣闊的應用前景，我國傳統藥材鹿茸就是一種很好的抗皮膚衰老藥物。作者在前期研究發現，將鹿茸制成膏劑外用于衰老模型小鼠皮膚具有很好的抗衰老效果，為此探索比單一鹿茸成分抗衰老效果更佳，且成本較低的抗衰老護膚產品，我們于2020年3月至2021年5月將鹿茸和一些具有抗衰老功效的植物藥——黃芪［3-4］、枸杞［5］、玉竹［6-7］、紅花［8］、天山雪菊［9］等進行復配，并以自研的納米乳為基質，再添加增稠和防腐等成分，試制出一種鹿茸復方抗衰老乳液，再將該乳液外用于衰老模型小鼠以檢驗其抗皮膚衰老的效果，為開發以鹿茸為主要成分的抗衰老護膚品進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 鹿茸新鮮血茸片（銅川鹿苑實業有限公司）；黃芪、枸杞、紅花、玉竹（西安老百姓大藥房韓森東路店）；天山雪菊（新疆百草堂醫藥連鎖經營部新華南路店）；D-半乳糖（上海藍季生物）；吐溫80（天津市富宇精細化工有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）；乙酸乙酯（天津市富宇精細化工有限公司）；黃原膠（天津光復精細化工研究所）；去離子水（天根生化科技（北京）有限公司）；尼泊金乙酯（天津大茂化學試劑廠）；尼泊金丁酯（天津大茂化學試劑廠）；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法）（上海碧云天生物技術有限公司）；羥脯氨酸試劑盒（堿）（南京建成生物工程研究所）；丙二醛測試盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（博士德生物工程有限公司）；青春復顏彈力乳液（北京同仁堂麥爾海化妝品公司）。

1.1.2 主要儀器設備 ELx800酶標儀（美國BioTek Instruments，Inc）；YP5002電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）；FW135中草藥粉碎機（北京永光明醫療器械有限公司）；YHG-400-S遠紅外干燥機（上海躍進醫療器械有限公司）；L530臺式離心機（湖南湘儀醫用儀器開發有限公司）；GEA-TM2剃毛器［創博環球（北京）生物科技有限公司］；T5-8W紫外燈（稷山縣安壹啟電商商務有限公司）。

1.1.3 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級，體質量（20±2）g，70只，雌雄各半，由西安交通大學醫學院提供，許可證號：SCXK（陜）2019-001，合格證號61001900003858，本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸復方乳液的配制 乳液是護膚品最常見的一種劑型，本復方乳液采用納米乳作為基質，納米乳是一種由粒徑在10～100 nm的乳滴形成的透明或者半透明液體載藥系統，具有極高的藥物溶解度以及生物利用度，且對水溶性和脂溶性成分都有良好的溶解度，還具有提高藥物穩定性的特性［10-11］，經多次實驗最終確定納米乳的配制方法為：取4 g吐溫80與29 g無水乙醇攪拌均勻，加入30 g乙酸乙酯，一邊攪拌一邊緩慢加入去離子水，直到形成澄清透明且出現丁達爾效應的納米乳液，當乳液由渾濁變為澄清時的臨界去離子水量為25 mL。將鹿茸、黃芪、枸杞、玉竹、紅花、天山雪菊以45 ℃烘干12 h，粉碎至200目，按照5∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，將混合粉末按照5%、10%、15%含量分別添加到納米乳液中充分混勻，制備成低、中、高濃度的鹿茸復方乳液，再添加5%的黃原膠進行增稠，添加0.1%尼泊金乙酯和0.1%尼泊金丁酯作為防腐劑［12］。同樣方法制備10%鹿茸乳液備用。

1.2.2 分組和造模 將70只小鼠按體質量均衡隨機法分為空白對照組、模型組、陽性組、鹿茸復方低劑量組（5%鹿茸復方乳液）、鹿茸復方中劑量組（10%鹿茸復方乳液）、鹿茸復方高劑量組（15%鹿茸復方乳液）、鹿茸乳液組（10%鹿茸乳液），每組10只，雌雄各半。除過空白對照組以外的各組注射D-半乳糖聯合紫外光照射誘導小鼠皮膚衰老模型，D-半乳糖劑量為1 g·kg-1·d-1，紫外燈波長為365 nm，在40 cm高度照射40 min/d，照射前剃除背部毛發?？瞻讓φ战M也做剃毛處理，注射同體積生理鹽水［13-15］。按上述方法連續處理42 d后，造模各組皮膚松弛，擠壓時出現細密皺紋，而空白對照組上述特征不明顯，然后對各組予以給藥處理。

1.2.3 外用給藥 空白對照組不予處理，用來和模型組相比對皮膚衰老模型是否誘導成功，其余各組小鼠在背部裸露皮膚選3 cm×5 cm大小區域，模型組涂抹納米乳0.5 g/d，低劑量組涂抹含5%鹿茸復方乳液0.5 g/d，中劑量組涂抹含10%鹿茸復方乳液0.5 g/d，高劑量組涂抹含15%鹿茸復方乳液0.5 g/d，陽性組我們選擇了一種北京同仁堂出品的“青春復顏彈力乳液”作為陽性對照，該產品具有滋潤肌膚、緊致去紋、延緩衰老、保濕補水的作用，也按照0.5 g/d外用涂抹，以上各組連續處理42 d。

1.2.4 皮膚外觀觀察及皮膚樣本的采集 比對給藥后各組小鼠用藥部位皮膚的色澤、光滑程度、皺紋等表觀特征并拍照記錄，然后禁食24 h，將小鼠皮膚清潔后處死小鼠，剪下涂藥部位皮膚，剔除皮下組織，用預冷的生理鹽水漂洗，濾紙拭干。

1.2.5 皮膚含水率、透明質酸含量、羥脯氨酸含量的測定 用直徑2 cm打孔器切取皮膚樣本，精確稱取其濕重，再放入烘箱中以80 ℃烘干12 h，稱其干重，計算皮膚含水率，皮膚含水率=（濕重-干重）/濕重×100%。取皮膚組織100 mg剪碎放入玻璃勻漿器，加入0.9 mL預冷的磷酸緩沖鹽溶液，在冰水中制成勻漿液，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照透明質酸試劑盒說明書的所示方法測定透明質酸含量。皮膚膠原蛋白含量一般可以通過測定羥脯氨酸來反映，取皮膚組織100 mg剪碎放入試管，加入1 mL水解液，加蓋后95 ℃水浴20 min，按照羥脯氨酸試劑盒說明書所示方法測定羥脯氨酸含量。

1.2.6 SOD活力、丙二醛含量的測定 取皮膚組織100 mg剪碎放入勻漿器，加入0.9 mL預冷的生理鹽水，在冰水中制成勻漿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照SOD試劑盒說明書所示方法測定SOD活力。取皮膚組織100 mg剪碎，加入0.9 mL預冷的生理鹽水，在冰水中制成勻漿液，按照丙二醛試劑盒說明書所示方法測定丙二醛含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用來表示，不同組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠皮膚表觀特征 造模42 d后，與空白對照組小鼠比較，模型組小鼠的皮膚明顯松弛，推擠后皺褶較多，體毛再生較慢，而對照組上述變化不明顯。再給藥42 d后，鹿茸復方低、中、高劑量組、陽性組、鹿茸乳液組與模型組相比，在皮膚松弛、皺褶等方面都有所改善。

2.2 小鼠皮膚含水率、透明質酸、羥脯氨酸含量測定結果 與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚含水率、透明質酸及羥脯氨酸含量均顯著降低（P＜0.05），表明皮膚衰老模型制備成功。和模型組比較，鹿茸復方低、中、高劑量各組皮膚的含水率和羥脯氨酸含量都顯著提高（P＜0.05）；低劑量組透明質酸含量較模型組提高但差異無統計學意義（P＞0.05），中、高劑量組皮膚的透明質酸含量都顯著提高（P＜0.05）。和陽性組比較，鹿茸復方低、中、高劑量各組皮膚含水率均顯著高于陽性組（P＜0.05）；中劑量組皮膚的透明質酸和羥脯氨酸含量高于陽性組但差異無統計學意義（P＞0.05），高劑量組的透明質酸和羥脯氨酸含量顯著高于陽性組（P＜0.05）。和鹿茸乳液組比較，鹿茸復方中、高劑量組皮膚含水率高于鹿茸乳液組但差異無統計學意義（P＞0.05）；鹿茸復方中劑量組皮膚的透明質酸含量和羥脯氨酸含量與鹿茸乳液組差異無統計學意義（P＞0.05），鹿茸復方高劑量組的透明質酸含量和羥脯氨酸含量顯著高于鹿茸乳液組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠皮膚組織含水率、透明質酸含量、羥脯氨酸含量的測定/

注：①與模型組比較，P＜0.05。②與陽性組比較，P＜0.05。③與鹿茸乳液組比較，P＜0.05。

組別空白對照組模型組鹿茸復方低劑量組鹿茸復方中劑量組鹿茸復方高劑量組陽性組鹿茸乳液組F值P值羥脯氨酸含量/（μg/mg）0.39±0.12①②③0.16±0.21②③0.35±0.12①0.46±0.18①0.57±0.23①②③0.45±0.29①0.46±0.10①151.84＜0.001鼠數10 10 10 10 10 10 10含水率/%78.93±5.32①②③50.44±13.77③67.74±11.37②③72.76±8.13①②76.00±11.13①②53.23±6.62③72.30±6.09①②92.01 0.012透明質酸含量/（μg/mg）10.55±0.95①②③6.87±2.34②③7.20±3.76①②③8.44±2.20①9.62±2.94①②③8.07±3.69①8.40±2.13①137.76 0.009

2.3 對小鼠皮膚SOD活力、丙二醛含量的影響測定 與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚SOD活力顯著下降（P＜0.05），丙二醛含量顯著上升（P＜0.05）。與模型組比較，鹿茸復方低、中、高劑量組的SOD活力顯著提高（P＜0.05），丙二醛含量都顯著降低（P＜0.05）。和陽性組比較，鹿茸復方低、中、高劑量各組的SOD活力均顯著高于陽性組（P＜0.05），丙二醛含量均顯著低于陽性組（P＜0.05）。和鹿茸乳液組比較，鹿茸復方低、中劑量組SOD活力均顯著低于鹿茸乳液組（P＜0.05），鹿茸復方高劑量組SOD活力顯著高于鹿茸乳液組（P＜0.05）；鹿茸復方低劑量組丙二醛含量低于鹿茸乳液組但差異無統計學意義（P＞0.05），鹿茸復方中、高劑量組丙二醛含量均顯著低于鹿茸乳液組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠皮膚組織超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛含量的測定/

注：①與模型組比較，P＜0.05。②與陽性組比較，P＜0.05。③與鹿茸組比較，P＜0.05。

丙二醛含量/（nmol/mL）3.41±0.67①②③9.76±6.13②③5.05±2.59①②③4.04±1.17①②③3.89±2.33①②③6.40±2.13①③5.62±1.57①②184.32＜0.001組別空白對照組模型組鹿茸復方低劑量組鹿茸復方中劑量組鹿茸復方高劑量組陽性組鹿茸乳液組F值P值鼠數10 10 10 10 10 10 10 SOD活力/（μ/mg）158.67±15.91①②③48.11±1.83②③75.94±4.05①②③107.34±4.58①②③143.33±8.50①②③57.91±2.25①③129.39±9.09①②218.80＜0.001

3 討論

一般認為，隨著年齡的增長，皮膚組織的自由基含量增多，過量的自由基破壞成纖維細胞的細胞膜、線粒體、核酸等細胞結構，導致膠原蛋白合成減少，透明質酸含量下降，皮膚含水率下降，而紫外線則是導致皮膚衰老的外在誘因，過量紫外線促使產生過氧化脂質，過氧化脂質使膠原蛋白交聯，皮膚失去彈性產生皺紋，過氧化脂質在氧化酶作用下還可以分解成丙二醛，與蛋白質反應形成褐色素，造成皮膚色斑和暗沉，紫外線造成的皮膚細胞損傷還會引起膠原蛋白和透明質酸含量的減少［16-20］。中藥主要通過清除自由基、調節神經內分泌、調節免疫功能、保護和修復DNA、延緩端粒的縮短等機制實現抗衰老［19］。鹿茸是梅花鹿處于旺盛生長階段的幼角，每天最多可生長2～3 cm，其內部富含多種促進生長的成分，鹿茸抗衰老的有效成分包括蛋白多肽類、氨基酸、糖類、生物胺類、甾體類、脂類和無機元素。蛋白多肽類是鹿茸最主要的活性成分，與抗衰老有關的肽類主要是酶類和生長因子類，酶類包括具有抗氧化、抗衰老作用的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、單胺氧化酶等，生長因子主要是胰島素樣生長因子、表皮生長因子等，這些物質能夠促進皮膚成纖維細胞的功能，增加膠原蛋白和透明質酸的合成。鹿茸中的糖類包括硫酸軟骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，這些成分往往具有抗氧化或者保濕的作用。鹿茸多胺可以抗脂質過氧化，促進核酸和蛋白質合成。鹿茸中的甾體類包括雌二醇、膽甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睪丸酮、膽甾-3，5-二烯，5a-膽甾-7-烯-3-酮等成分，這些激素類成分能夠抑制黑色素細胞絡氨酸酶活性、促進成纖維細胞增生和增加膠原蛋白和透明質酸合成、抑制炎癥形成、延緩皮膚衰老。研究證實外用全組分鹿茸可以起到很好的抗皮膚衰老效果，其抗皮膚衰老功效是由所含的多種組份互相協同而產生［20-21］。而黃芪、枸杞、紅花，玉竹、天山雪菊這些藥物富含酮、酚、多糖等活性成分，可以有效清除自由基，增強SOD活力，降低過氧化脂質，促進膠原蛋白合成［9-15］，因此將這些中藥材合理配伍，可能會幫助我們開發出較單一藥材效果更好的抗衰老護膚產品。本研究表明，5%鹿茸復方抗衰老乳液，在提高衰老模型小鼠的皮膚含水率、羥脯氨酸含量、增強SOD活力、降低丙二醛含量等四個指標具有明顯效果（P＜0.05），在提高含水率和增強SOD活力兩個指標上略優于陽性組，差異無統計學意義（P＞0.05）。10%鹿茸復方抗衰老乳液即可在提高皮膚含水率、透明質酸、羥脯氨酸含量、增強SOD活力、降低丙二醛含量等全部五個指標都具有明顯效果（P＜0.05），而且各指標均優于陽性組（P＜0.05）。10%鹿茸復方乳液在提高衰老模型小鼠的皮膚含水率、透明質酸、羥脯氨酸含量三個指標上，與鹿茸乳液組的效果差異無統計學意義（P＞0.05），降低丙二醛含量的效果顯著優于鹿茸乳液組（P＜0.05），增強SOD活力方面10%鹿茸乳液優于10%鹿茸復方乳液（P＜0.05），但考慮到和模型組比較，鹿茸復方低、中、高劑量組均已達到顯著提高SOD活力的效果（P＜0.05），所以總體來說，10%鹿茸復方乳液的抗衰老效果相當于10%鹿茸乳液，但是減少了一半的鹿茸用量，有利于產品成本的控制。

綜上所述，外用10%鹿茸復方乳液具有顯著的抗皮膚衰老功效，且抗衰老效果總體優于陽性藥物，相當于10%鹿茸乳液，且成本較低，因此10%的鹿茸復方乳液為該組方的最佳濃度，在后續的研究中我們將對本配方做進一步優化。