農類院校養殖實訓場易感動物結核病及布氏桿菌病監測與凈化

黃小佳，林廣津，張業懷，凌 丁

廣西農業職業技術大學，南寧 530007

布氏桿菌病和結核病（以下簡稱“兩病”）都是人畜共患病，養殖從業者、基層獸醫工作人員和教學實訓場所的師生均屬于人畜共患病感染高危人群。“兩病”的病原菌可通過人畜呼吸道、消化道、生殖道或皮膚、黏膜進行傳播，人類接觸帶菌動物或食用帶菌的乳制品或未煮的肉類均可被感染。為了做到源頭治理，確保師生和動物的安全，2020年筆者所在課題組針對農類院校養殖實訓場及其未來多功能作用的實際情況，利用動科系微生物實驗室，對養殖實訓場動物進行布氏桿菌和結核病調查，并對調查結果進行分析，為指導農類院校養殖實訓場防控布氏桿菌病和結核病等人畜共患病的安全防護機制提供科學依據，同時為其他院校開展人畜共患病防控及凈化工作提供借鑒。

1 養殖實訓場基本情況

1.1 養殖實訓場內部設施設備及周邊環境情況

養殖實訓場于2014年建成，2015年投入使用，主要由現代養豬場、臨床診療大棚、綜合養殖舍、化尸池等構成。綜合養殖舍被柵欄劃分為牛舍、羊舍、犬舍，各欄舍之間是在同一環境下有公共的通道相通，同時各種動物欄舍缺少防鼠防蟲設施，這種設計的缺陷給生物安全防控帶來了隱患。養殖實訓場周邊是農學、園藝及中草藥實訓基地，附近3 km 范圍內無其他動物飼養。

1.2 實訓動物飼養和使用情況

養殖實訓場目前牛11 頭、羊19 只、馬5 匹、犬45 只、兔33 只、禽97 羽。由于受非洲豬瘟的影響，豬存欄為零。動物的來源方式主要為購進，所有動物的飼養模式為圈養。動物的種類和數量隨實訓課的開展時間、項目而變動，實訓課多、班級多，試驗動物總體數量多。

1.3 “兩病”歷年發病情況調查

為全面了解養殖實訓場“兩病”發生現狀，通過查資料及回訪曾經在位工作的教師方式在校院內開展“兩病”流行病學調查。歷年調查發現，養殖實訓場沒有“兩病”發病記錄，即使近幾年，隨著試驗動物養殖數量和實驗場所人員流動性增加，“兩病”也未有發生及疫情報道。根據南寧市疾控中心統計數據，2019年該學院發生了3 例人的結核病病例。但據文獻報道，2011—2014年南寧市常住人口結核病累計28 893 例，年均發病率為0.0537%，總體上病例呈逐年上升趨勢[1]。可見，“兩病”防控形勢依然嚴峻。

2 結核病和布氏桿菌病檢測

2.1 結核病檢測

①試驗材料。（提純）牛型結核菌素（20 mL、2萬/mL）、禽型結核菌素（凍干）均購自中國獸醫藥品監察所。油標卡尺；一次性1 mL 注射器、推剪、一次性帽子、一次性口罩、手套、記號筆等。

②檢測動物。養殖實訓場所有存欄易感動物。

③試驗方法。試驗方法及判定標準參照GB/T18646-2002（動物結核病的操作規程）國家標準要求進行。采用結核菌素皮內變態反應（PPD）試驗進行檢測，同時根據動物種類不同選擇不同的結核菌素、注射部位、注射劑量及判定標準，詳見表1。

④操作方法。所有待檢動物都要進行術前處理：將待檢動物編號后在注射部位剪毛，并用油標卡尺測量術部中央皮皺厚度，做好記錄。將結核菌素稀釋成所需要的濃度備用。注射方法：先以75%乙醇消毒注射部位，然后注射一定量結核菌素，如是皮內注射，注射后局部會出現小包，如注射后不出現包時，應另選大于15 cm 以外的部位或對側重做。觀察結果及處置：注射72 h 后，觀察注射部位是否有熱痛、腫脹等炎性反應，并測量注射部位的皮皺厚度，做好記錄。對疑似反應牛應立即在另一側注射同批號同劑量結核菌素，再經72 h 觀察并記錄結果。結果判定：不同的動物判定標準有所不同，詳見表1。

表1 養殖實訓場實訓動物結核桿菌病檢測注射部位、劑量及判定標準

⑤檢出可疑動物的處理。凡判定為可疑結核病的動物，過42 d 后再進行1 次復檢，檢測結果是陰性，則判為陰性；檢測結果是陽性，定為陽性；若檢測結果仍呈可疑反應者，則再間隔42 d 復檢1 次，結果仍為可疑反應者，則按陽性動物處理[5]。復檢結果見表2。

表2 養殖實訓場實訓動物結核桿菌病初檢及可疑病例復檢結果 例

2.2 布氏桿菌病的檢測

①儀器與耗材。電熱恒溫培養箱、海爾冰箱、高速離心機LD-2.4、1.5 mL 塑料離心管、50～100 μL移液器、一次性5 mL 注射器、載玻片、吸嘴、試管架、試管等。

②診斷試劑。布氏桿菌虎紅平板凝集試抗原、試管凝集抗原、陽性血清、陰性血清均購自中國獸醫藥品監察所。

③待檢動物。全場存欄易感動物。

④血液的采集及血清的制備。血液采集使用一次性注射器，采血量5 mL，不同實訓動物的采血部位、方法不同[6]，具體見表3。

表3 實訓動物采血部位、方法

采血完畢，將注射器針頭向下使整個注射器與地面垂直，并輕輕向上抽動一下活塞，使血液與出口留有1.0 mL 左右的空隙，套上針頭套，室溫自然凝固后，放入37 ℃的恒溫培養箱1 h 取出，放在室溫3～5 h 或冰箱24 h 存放后，就可看見淡黃色的血清析出。將注射器的針頭、針套取下后，將析出的血清慢慢注入一次性的塑料離心管中，并編號放入-26 ℃冰箱冷藏室，保存備用。

⑤血清檢測方法。將所有待測動物的血清先用布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗進行初步檢測，結果判為疑似反應的再用布氏桿菌病試管凝集試驗進行復檢。

⑥虎紅平板凝集試驗方法及結果判定標準。參照國家標準GB/T18646-2002 動物布氏桿菌檢測的操作技術進行。先在滅菌潔凈的玻璃板上，用記號筆劃出三格，分別放入20 μL 虎紅平板凝集抗原，然后分別吸取等量的被檢血清、陽、陰性血清分別放入并混勻，在5 min 內出現肉眼可見凝集顆粒現象判為陽性；無凝集現象，且液體呈均勻粉紅色者判為陰性。

⑦試管凝集試驗方法及結果判定標準。首先將血清稀釋成1∶12.5、l∶25、1∶50、1∶100 4 個稀釋度。加入等量稀釋好的抗原并混勻，此時血清稀釋度依次為l∶25、1∶50、1∶100、1∶200。同時，進行陰性對照、陽性對照及抗原對照試驗，并配制比濁管。然后將所有的試管、對照管及比濁管充分振蕩后置37 ℃恒溫培養箱24 h，取出觀察并記錄結果。判定標準：參照比濁管及各試管上層液體透明度、管底沉淀物的量進行判定。①++++：管底有明顯凝集物下沉，上層液體完全清亮；②+++：管底有凝集物下沉，上層液體75%清亮；③++：管底有凝集物，液體50%清亮；④+：管底有少量凝集物沉淀，液體25%清亮；⑤－：管底無凝集物，管內液體均勻混濁[7]。

2.3 結 果

應用結核菌素對養殖實訓場牛、羊、馬、犬、免、禽等6 種動物共210 例進行檢測，陽性率為0.95%，說明該養殖實訓場實訓動物中存在結核病的感染（表2）。

應用虎紅平板和試管凝集試驗對113 份來自養殖實訓場牛、羊、馬、豬、犬、免的血清樣品進行檢測，檢出陽性血清0 份，血清陽性率為0，說明目前在養殖實訓場實訓的動物沒有感染布氏桿菌病，檢測結果詳見表4。

表4 養殖實訓場動物布氏桿桿菌病檢測結果 例

3 討 論

3.1 結核病

應用結核菌素對養殖實訓場牛、羊、馬、犬、免、禽等6 種動物210 例進行檢測，其中牛11 頭、羊19只、馬5 匹、犬45 只、免33 只、禽97 羽。檢出陽性牛1 頭、陽性犬1 只，其余羊、馬、免、禽未檢出陽性，說明該養殖實訓場存在結核病感染，檢疫、隔離、消毒等綜合防控措施應進一步加強，以達到凈化目的。

3.2 布氏桿菌病

本次采集各類動物血清113 份。其中，牛11份、羊19 份、馬5 份、犬45 份、免33 份。所有的血清中未檢出陽性，血清陽性率為0，說明該養殖實訓場布氏桿菌病防控工作取得了一定的效果。

3.3 疾病來源

從調查中了解到，陽性牛和犬都是歷年中標商從農貿市場購進，送貨時沒有帶有動物檢疫合格的證明，送貨之后也沒有進行“兩病”檢測。對于檢出的陽性牛、犬立即報告學院并采取了隔離、深埋、消毒等無害化處理，并認真做好登記備案及全場全面消毒等善后工作。

4 存在的問題及對策

4.1 存在的問題

養殖實訓場所是教學實訓的重要基地，師生應高度重視結核病、布氏桿菌檢測凈化和防控，但在調查中發現，該養殖實訓場還存在以下問題。

1）管理制度缺失。嚴格的管理制度是養殖實訓場正常運行及動物健康的重要保證。目前，該養殖實訓場各項安全管理制度未形成文件，包括試驗動物購進原則、試驗動物使用規范、衛生防疫制度、試驗廢棄物無害化處理制度、生物安全教育培訓及動物檢疫制度等管理制度未出臺。即使購進的是健康動物，但在養殖過程中有可能感染疫病。由于制度的不完善，該場管理工作形同虛設，導致常規的“兩病”檢測也被忽略。

2）實訓廢棄物處理不徹底。養殖實訓場教學試驗和科研過程中產生多種醫療廢棄物，如一次性PE手套、針頭、一次性塑料注射器及動物的組織、血樣品、器官、尸體等。目前，只有一次性塑料注射器進行收集，由專門的機構來定期收集、處置，其余的多種廢棄物由學生課后直接作為生活垃圾扔入垃圾桶；化尸池設計存在容量小、使用不到1年動物尸體很快填滿，無處安放的動物組織樣品、器官、死亡動物尸體則隨意填埋，易造成病原微生物擴散。

3）生物安全教育不到位。調查發現，多數教師、學生的生物安全的意識處于空白狀態，對人畜共患病的防范意識更是薄弱，表現在教師在進行動物解剖或臨床診斷時不戴手套和口罩，徒手進行操作。學生也沒按要求進行實訓，未養成操作前戴手套的習慣，甚至存在一邊上課一邊吃食物的現象，離開實訓場所時沒養成洗手的習慣。

4）試驗動物來源背景復雜。目前，教學實訓所需要的試驗動物幾乎是從市場購進，而且由于試驗經費和動物欄舍限制，存欄動物種類和數量是隨實訓需要而變動，多數情況下課程教學需要時才從農村或農貿市場上購買，而且是即買即用沒進行任何檢疫。動物的防疫狀況、健康狀況更無法了解。另外，部分試驗動物購進時，只要求價格便宜，購進私自生產試驗動物，或未要求動物中標公司提供有關檢疫合格證明，這些均會導致一些攜帶病原微生物或已被感染的處于亞健康狀態的動物流入養殖場所，給師生造成安全隱患。

4.2 對 策

“兩病”的防控是一項長期而艱巨的工作，況且養殖實訓場承擔著重要教學任務，其“兩病”的防控除了采取養殖業常規的監測、檢疫、隔離、消毒和科學管理等綜合性防治措施，堅持自繁自育，全進全出的管理體制外，還要做好以下工作。

1）完善并落實管理制度。完善養殖實訓場嚴格的生物安全管理制度；重視并落實師生的生物安全教育培訓，讓師生意識到安全防護對于減少疫病傳播有著重要作用；從養殖實訓場的實際情況出發，把各項規定、要求及制度落到實處，設置生物安全管理崗位責任人，并層層落實安全管理責任；建設與改造養殖實訓場動物欄舍，設置有防外來生物入侵的設施，不同的動物欄舍分區設計分別飼養，以避免交叉污染；規范化處理廢棄物，以減少污染物的擴散，實現從源頭上減量控制。

2）加強檢測與凈化工作。每年春秋兩季針對健康動物，利用學生實訓的機會開展全面的檢測，通過檢測工作的開展，早期發現異常動物，并采取針對性措施將傳染源清除，使“兩病”達到凈化的效果。在試驗動物引進過程中，要求中標公司選擇有產地檢疫合格的動物引進，動物運回后應進行30 d以上隔離觀察飼養，并進行2 次免疫生物檢查，陰性者才能合群。