噴施3種商品化納米顆粒對黃瓜綠斑駁花葉病毒病的防效初探

羅金燕， 謝婷， 陳磊， 杜偉， 張健男， 朱潔， 安千里， 李斌*

(1.上海市農業技術推廣服務中心， 上海 201103； 2.浙江大學 生物技術研究所， 浙江 杭州 310058；3.寧夏回族自治區農業技術推廣總站， 寧夏 銀川 750001； 4.溫州市植物保護與土壤肥料管理站， 浙江 溫州 325000)

黃瓜綠斑駁花葉病毒在世界范圍內分布廣泛，其寄主主要為葫蘆科作物，對瓜類作物危害極大。危害西瓜時，前期主要癥狀為花葉斑駁，在西瓜生長后期還可能引起果肉組織嚴重纖維化導致空腔，形成“倒瓤”，嚴重影響果實的食用與經濟價值[1]。CGMMV一旦暴發就會給西瓜產業造成巨大經濟損失。據報道，2005年我國遼寧蓋州CGMMV大暴發，造成當地西瓜大面積絕收[2]。CGMMV可穩定存在于種子表皮與內種皮，帶毒種子是CGMMV傳播的主要途徑，目前生產上主要以種子干熱消毒預防為主，輔以藥劑等手段進行綜合防控，但干熱消毒通常影響種子活力。

納米顆粒通常是指被定義為1～100 nm的粒子，由于其獨特的理化特性和良好的抗菌性能，近年來在農業生產上被廣泛使用，為病害綠色防控提供了新策略。氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)和二氧化硅納米顆粒(SiO2NPs)對人體無毒且易于制備，有研究[3]表明，ZnO NPs或SiO2NPs可通過直接影響病毒和提高植物自身的防御能力來保護本氏煙免受TMV侵害。二氧化鈦納米顆粒(TiO2NPs)也是最常制備的納米顆粒之一，研究[4]表明，TiO2NPs可能通過激發活性氧(ROS)產生來防治植物病害。這些研究證明納米顆粒在植物病毒防控中具有較好的潛力。

本研究選用ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs這3種商品化的納米顆粒，制備成2 mmol·L-1的溶液對健康西瓜植株進行葉面噴施，連續處理3 d后接種CGMMV，以無菌水處理為對照，待植株發病后檢測各個處理組植株的生物量、葉綠素含量與病毒積累量，以此初步探究商品化納米顆粒對CGMMV的防控效果。

1 材料與方法

1.1 供試西瓜品種和納米材料

供試西瓜品種為市購的早佳8424西瓜種子。供試納米材料：ZnO NPs(平均粒徑為30 nm)(上海麥克林生化科技有限公司)；TiO2NPs(平均粒徑為20 nm)(上海麥克林生化科技有限公司)；SiO2NPs(平均粒徑為30 nm)(上海超威納米科技有限公司)。

1.2 供試西瓜植株的處理

用玻璃瓶盛2/3體積的蒸餾水，取適量供試西瓜種子倒入玻璃瓶中，50 ℃水浴40 min，在育苗盤中鋪一層用蒸餾水潤濕的尼龍紗布，將西瓜種子放在上面并置于28 ℃溫箱中催芽2～3 d，發芽的西瓜種子移栽到花盆里，置于28 ℃，光照16 h，黑暗8 h的溫室中生長。

1.3 納米顆粒的噴施

當西瓜幼苗長至二葉一心期，將ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs 這3種商品化納米顆粒分別配制成終濃度為2 mmol·L-1的懸浮液，超聲振蕩30 min使納米顆粒完全分散，在西瓜真葉葉面噴施，用量為5 mL，對照植株噴施等量無菌水(ddH2O)；連續噴施3 d，讓納米顆粒滲透到植物體內，每個處理選用10株西瓜苗，設置3個重復，以確保數據的重現性。

1.4 CGMMV的接種

第3天噴施納米顆粒的西瓜幼苗，在處理后的24 h內接種CGMMV。具體方法為取系統感染CGMMV的西瓜老葉，將植物葉片按照1∶10的比例(m/V，g·mL-1)在接種Buffer(0.01 mol·L-1PBS)中研磨成勻漿，在800目石英砂覆蓋的兩片西瓜真葉上摩擦接種CGMMV；接種病毒后的西瓜苗移至防蟲溫室中，設置生長參數為：光照28 ℃，16 h；黑暗25 ℃，8 h；濕度為75%；1～2周植株發病后通過調查病毒的增殖和西瓜植株的發病嚴重程度以及生物量、葉綠素含量等生理指標的變化，以評估各納米顆粒對CGMMV感染的影響。

1.5 生物量的檢測

1～2周植株發病后，分別測量各個組別的株高、總鮮重、總干重。將植株的根際土壤洗干凈，擦干后測量ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs、對照4個處理組的株高、鮮重；將新鮮植株用錫箔紙包裹，放置于烘箱中105 ℃烘48 h以上，至質量不再變化后測量該恒重，從而計算出各個組別的干重。

1.6 葉綠素含量的檢測

待1～2周植株發病后，將每個處理組植物的第4片真葉混合形成一個生物重復，采用80%丙酮浸提比色法[5]提取葉綠素，利用紫外分光光度計測定色素提取液在波長663 nm和645 nm處的吸光度，以80%丙酮作為空白對照調透光率100%，每個樣品重復測定3次。將測得的吸光度(D)代入公式(1)、(2)、(3)中，計算葉綠素a、b濃度與總濃度，再將葉綠素a、b濃度與總濃度代入公式(4)中求出所測材料單位的葉綠素a、b含量與總含量。

葉綠素a=12.7×D663-2.69×D645；

(1)

葉綠素b=22.9×D645-4.68×D663；

(2)

葉綠素a+b=20.21×D645+8.02×D663；

(3)

葉綠素總含量=(葉綠素a+b)×V÷1 000×m×n。

(4)

式中:V為提取液總體積；m為取樣鮮重;n為稀釋倍數。

1.7 CGMMV外殼蛋白基因的表達

通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測植株CGMMV基因表達，以判斷植株是否被病毒侵染。接種后7 d采集葉片樣本，將每個處理植物的葉子混合形成一個生物重復。利用TRIzol法提取西瓜葉片的總RNA，電泳檢測RNA的完整度，以提取的總RNA為模板合成cDNA，以合成的cDNA作為RT-PCR的模板，使用CGMMV外殼蛋白特異性引物[6](CGMMV-F/R：5′-ATGGCTTACAATCCG ATCACAC-3′/5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC-3′)進行RT-PCR。

1.8 CGMMV病毒粒子的ACP-ELISA檢測

通過ACP-ELISA方法定量檢測CGMMV病毒的含量。具體方法是先將植物組織按1∶20比例(m/V，g·mL-1)在1×PBS中研磨成勻漿，離心后將上清加于96孔ELISA微孔板上(每孔100 μL)，4 ℃過夜包被，每個處理3次重復。參考何宛芹[7]的方法進行ACP-ELISA，略有改動，使用CGMMV一抗(1∶5 000倍稀釋)，在顯色時使用AP顯色底物溶液；顯色完成終止反應后，用酶標儀(Bio-Rad 680)進行光密度吸光值D405的測量，每個實驗重復3次。以上試驗數據均采用鄧肯式新復極差法(DMRT)進行分析和顯著性測定。

2 結果與分析

2.1 納米顆粒處理對西瓜生物量的影響

接種1～2周后，西瓜植株出現CGMMV癥狀，但處理組和對照組病害癥狀差異不明顯；長勢觀察發現3種納米顆粒處理的植株株高與對照組植株相比無顯著差異；ZnO NPs處理植株與對照植株的生物量相比也無明顯差異，但TiO2NPs和SiO2NPs處理的西瓜植株長勢明顯優于對照(圖1)，說明體外噴施這2種商品化納米顆粒可以增加感染CGMMV西瓜植株的總鮮重和總干重，2個處理組別的總鮮重與總干重均顯著高于對照組(表1)。

圖1 噴施納米顆粒對感染CGMMV西瓜植株長勢和葉片的影響

2.2 納米顆粒處理對葉綠素含量的影響

CGMMV侵染的一個典型癥狀就是植株葉片褪綠黃化，因此，葉綠素含量的檢測不僅可以評判植株長勢，也能在一定程度上反映植株感染CGMMV的發病程度。將每個處理植物的第4片真葉混合形成一個生物重復，采用80%丙酮浸提比色法檢測葉綠素含量。結果表明，在感染CGMMV的情況下，體外噴施商品化ZnO NPs的西瓜植株葉綠素含量與對照植株無明顯差異；但噴施商品化TiO2NPs、SiO2NPs的西瓜植株葉綠素含量顯著高于對照植株(圖1、表1)。

表1 不同納米顆粒處理對感染CGMMV西瓜植株生物量、葉綠素含量和帶病毒量的影響

2.3 納米顆粒處理對外殼蛋白基因表達的影響

凝膠電泳檢測發現利用TRIzol法提取的RNA較為完整(圖2中A)，通過RT-PCR在各個納米顆粒處理和對照組均擴增到了CGMMV特定的 486 bp 片段，從一定程度上證實了所有測試的西瓜植株均被CGMMV成功感染(圖2中B)。

A—總RNA；B—RT-PCR圖2 納米顆粒處理感染CGMMV西瓜植株的外殼蛋白表達

2.4 納米顆粒處理對CGMMV含量的影響

ACP-ELISA中測得的D405值表示植株中含有的CGMMV外殼蛋白與CGMMV特異性抗體的結合量，即可以表征各個處理組CGMMV病毒外殼蛋白的積累量。結果(表1)顯示，與對照組相比，TiO2NPs、SiO2NPs和ZnO NPs預處理的西瓜植株CGMMV外殼蛋白積累量均顯著低于對照，表明這3種納米顆粒對CGMMV繁殖有一定的抑制作用。

3 小結

本研究測定了在西瓜葉面噴施ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs這3種商品化納米顆粒對系統感染CGMMV西瓜植株的生物量、葉綠素含量以及病毒積累量的影響，結果表明，經過TiO2NPs和SiO2NPs處理的植株在感染CGMMV后的長勢優于無菌水對照植株，具體表現為植株總鮮重和總干重比對照組顯著增加，但各納米顆粒處理組與對照組的株高無明顯差異。此外，體外噴施TiO2NPs和SiO2NPs的感染CGMMV西瓜植株的葉綠素含量顯著高于對照植株，而ZnO NPs處理植株的生物量、葉綠素含量與對照植株無顯著差異。研究還發現，連續3 d葉面噴施3種納米顆粒可顯著降低CGMMV外殼蛋白積累量，初步推測可能是通過破壞CGMMV的方式減少了病毒的復制增殖。TiO2NPs和SiO2NPs增加西瓜植株生物量與葉綠素含量或許是因為他們誘導了植物的抗病能力，從而部分抵消植株因病毒侵染所帶來的負面影響。

在農業生產中，納米顆粒的使用已被報道可以減少病原體的數量、控制病害和雜草以及提高作物的生長速度[8]，但其僅在一定的濃度內對植物有益，過高濃度的納米顆粒也可能會對作物產生毒性。有研究表明，在300 mg·L-1TiO2NPs劑量水平下玉米的葉片生長受阻[9]。而本研究使用的納米材料濃度相對較低，基本上不會抑制植物的正常生長發育。與較大的顆粒相比，納米顆粒具有更高的表面體積比，這不僅增加了納米顆粒的滲透性，還增強了其與組織和細胞的相互作用，滲入植株的納米顆粒還可能為植物提供生長有益的微量元素從而起到促進植物生長的作用。下一步研究可以著重關注納米顆粒直接噴施健康植株對植物長勢與病程相關基因的表達變化。

CGMMV作為種傳的植物病毒病害，最有效措施是加強植物檢疫，選用無毒良種，力求將病毒封鎖在種植區外；一旦發生防治起來尤為困難，故生產上應以預防為主。本研究結果表明，葉面噴施商品化納米TiO2和SiO2顆粒在病毒侵染初期可以對植物起到一定的保護作用，對病毒的復制增殖也有一定抑制作用。相對于一些化學藥劑見效快，但治標不治本，且可能對植物產生藥害或抗藥性等副作用，納米顆粒往往具有對環境友好的殺菌殺毒特性，在病原細菌與真菌防控領域已初有成效，本研究表明，納米顆粒可能直接作用于CGMMV或間接誘導植物抗性，將來有望為CGMMV等植物病毒的防控提供一種有前景的替代方案。