蘿卜與甘藍型油菜遠緣雜交形成新種質的研究與探討

萬林生， 孫紅芹， 倪正斌， 韓配配， 陳志愛

(江蘇沿海地區農業科學研究所， 江蘇 鹽城 224012)

遠緣雜交是創造作物新品種的重要途徑，也是改良物種的有力工具。利用遠緣雜交技術，可打破種、屬間的隔離，拓寬遺傳基礎并為育種計劃創造新的種質，從而有效地進行種間、屬間目標遺傳物質的轉移。目前，遠緣雜交在油菜育種上已得到廣泛應用，并取得顯著成效。如用白菜型油菜與甘藍型油菜雜交，改良甘藍型油菜的熟性；甘藍型油菜與白菜型油菜、芥菜型油菜、羽衣甘藍等黃籽材料雜交，在雜交后代中選育出黃色種皮的甘藍油菜等[1-4]。

目前，國內外在甘藍型油菜與蘿卜遠緣雜交及雜種鑒定方面的研究雖有報道，卻為數不多。甘藍型油菜是經過白菜與甘藍種間雜交，加倍形成的異源雙二倍體，而蘿卜是十字花科一種非常重要的蔬菜。甘藍型油菜與蘿卜的雜交屬于蕓薹屬與蘿卜屬之間的遠緣雜交[5-6]。蘿卜屬作為蕓薹屬的近緣屬，具有許多優秀并有價值的基因，例如優良的抗逆、抗蟲性和抗病性。遠緣雜交可以將蘿卜中的優良基因轉移到甘藍型油菜中，從而拓寬甘藍型油菜的遺傳基礎，改良甘藍型油菜。

本試驗通過人工雜交獲得甘藍型油菜與蘿卜的遠緣雜種，并對雜種進行了分子標記鑒定，旨在拓寬甘藍型油菜的遺傳基礎，為相關性狀的轉移和創造新的生物材料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為油菜和蘿卜。油菜品種(母本)為甘藍型油菜Y5A、Y4-2A，均為江蘇沿海地區農業科學研究所自育油菜核不育品種;蘿卜品種(父本)為吉美紅皮、牛埔杙、春露、短葉十三，均為引進中國油料作物研究所蘿卜高抗根腫病品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 遠緣雜交

在江蘇沿海地區農業科學研究所南洋試驗場內根據蘿卜和油菜的生育期長短播種，以保證其花期相遇。以甘藍型油菜Y5A、Y4-2A為母本，以4種蘿卜品種為父本，共8組雜交組合。2021年4月開展油菜蘿卜雜交工作。將母本不育系套袋，當袋子中的母本開花十幾朵后，取父本蘿卜當天開放的新鮮花粉，涂抹在母本花朵柱頭上，套上雜交紙袋，掛好吊牌。授粉后1周去除紙袋。成熟時按組合和母本單株收獲，計數每一花序的結角數、每角的飽滿粒數、半飽滿粒數和癟粒數，并計算結角率與親和指數。

結角率=100%×獲得的角果數/授粉花朵數；親和指數=飽滿種子數/授粉花朵數。

1.2.2 分子標記鑒定F1真假雜交種

通過對甘藍型油菜、蘿卜及兩者的雜交F1代種子進行萌發和試驗培養，利用杭州博日的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取親本及其F1雜交種葉片的DNA。對親本基因組DNA進行高通量測序，組裝基因組信息并搜索全基因組中的SSR位點，并設計合成這些特異性位點相對應的引物，利用親本和雜交種的基因組DNA進行PCR擴增，確定引物的特異性、有效性，挑選出最合適引物用于雜交種的真實性鑒定。

2 結果與分析

2.1 遠緣雜交

由表1可以看出，甘藍型油菜Y5A為母本，以4種蘿卜品種為父本，得到23個角果，平均結角率0.07%。收獲后考種，得到雜交種子44顆，平均親和指數0.12。4個雜交組合中，Y5A/吉美紅皮沒有獲得雜交種子，Y5A/春露的雜交種子數最多，為 31顆，結角率0.15%，親和指數0.32。

表1 8個雜交組合田間結實情況

由表1可以看出，甘藍型油菜Y4-2A為母本，以4種蘿卜品種為父本，得到11個角果，平均結角率0.04%。收獲后考種，得到雜交種子21顆，平均親和指數0.08。4個雜交組合中，Y4-2A/吉美紅皮沒有獲得雜交種子，Y4-2A/春露的雜交種子數最多，為 12顆，結角率0.06%，親和指數0.14。

2.2 F1雜交種驗證

對甘藍型油菜和蘿卜進行基因組測序，從全基因組中的SSR位點及其設計的相對應引物里篩選了150對引物，利用這150對引物與甘藍型油菜(母本)、蘿卜(父本)及8株雜交F1代基因組DNA進行PCR擴增。初步篩選出在父母本間能擴增出清晰的特異性條帶的引物。再用篩選出的引物同時與親本和雜交F1代DNA進行PCR擴增，挑選出能在雜交F1代表現出同時具有父母本特異性條帶的合適引物，進行雜交種的真實性鑒定。

2.2.1 SSR引物篩選

2.2.1.1 親本和F1DNA提取

利用改良CTAB法提取親本和F1代幼嫩葉片的DNA。首先在磨樣機中加入一定量的幼嫩葉片及兩顆鋼珠，700 μL預熱的CTAB，磨樣機50 Hz磨樣3 min。隨后65 ℃水浴30 min。水浴后加入氯仿700 μL，劇烈振蕩，離心機12 000 r·min-1離心10 min，取500 μL上清液，加入等體積預冷的異丙醇，上下顛倒幾次，離心機12 000 r·min-1離心15 min。棄上清，加入適量的70%乙醇，振蕩，靜置。5 min后輕輕倒掉乙醇，放在衛生紙上倒置過夜。第二天加TE緩沖液200 μL，測定DNA含量。

2.2.1.2 分子標記開發

通過NCBI數據庫分別查找下載油菜(Radish_ v2.20)與蘿卜(Bra_napus_v2.0)的基因組序列，利用軟件BioEdit v.7.7.3.0 版本建立各自的基因組序列庫。使用蘿卜的某條染色體與其整個基因組序列對比，截取匹配程度低的部分。再使用所截取序列與甘藍型油菜基因組比對，在序列差異位置開發顯性標記。通過對比篩選，使該標記特異于油菜基因型序列和蘿卜的其他染色體。

PCR反應結束后進行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓150 V，時間35 min，上樣量5 μL。

最后篩選出5對引物，5對引物序列如下：

Primer17-F：5′-CCAATCCGACGATACAGGTT-3′；SEQ ID NO.1；

Primer17-R：5′-TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT-3′；SEQ ID NO.2；

Primer51-F：5′-TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA-3′；SEQ ID NO.3；

Primer51-R：5′-CACATTGGTTTGTTGGTTGC-3′；SEQ ID NO.4；

Primer125-F：5′-CTTGTTTCCACCCTTTTCCA-3′；SEQ ID NO.5；

Primer125-R：5′-TTTCAACCACCATTAACAAC CA-3′；SEQ ID NO.6；

Primer128-F：5′-TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA-3′；SEQ ID NO.7；

Primer128-R：5′-CACATCATGGCTTTCTCCAC-3′；SEQ ID NO.8；

Primer140-F：5′-CGCAAATTTTTGCAATAGAG C-3′；SEQ ID NO.9；

Primer140-R：5′-TTTTTAGATTTGGGATAATTC TTACT-3′；SEQ ID NO.10。

2.2.2 PCR擴增以及雜交種檢測

利用能在雜交F1代表現出同時具有父母本特異性條帶的引物，對獲得雜交種F1進行雜交種的真實性鑒定。利用引物128對結角率與親和指數均較高的Y5A/春露雜交8株F1代PCR擴增。圖1顯示，有5株單株擴增到兩親本特異條帶，鑒定為真雜種；其余3株單株只擴增到母本或父本特異性條帶，可能為假雜種。

圖1 引物128對部分遠緣雜交F1鑒定結果

3 討論

油菜遠緣雜交親和性的大小不僅受環境的影響，也受親本基因型親和力的影響。本試驗中以不同的不育系為母本和不同材料為父本遠緣雜交所得結果不同。以Y5A為母本時，春露為父本的雜交種子數最多，Y5A/春露的雜交種子數有31顆，結角率0.15%，親和指數0.32。以Y4-2A為母本時，春露為父本的雜交種子數最多，Y4-2A/春露的雜交種子數有12顆，結角率0.06%，親和指數0.14。油菜遠緣雜交過程中父母本的選擇和組配至關重要，這和前人研究結果一致[7-10]。

油菜和蘿卜的遠緣雜交較為困難，要確定雜交配組后獲得F1的真實性。本研究通過對甘藍型油菜、蘿卜基因組測序，挑選出能在雜交F1代表現出同時具有父母本特異性條帶的合適引物，鑒定F1的真實性。Y5A/春露雜交8株F1中顯示有5株單株擴增到兩親本特異條帶，鑒定為真雜種。

根腫病近年來已成為十字花科作物上重要的病害之一。我國油菜主產區內根腫病發病嚴重，對油菜產量造成巨大損失，打擊了農民種植積極性，威脅我國油料安全，加強對油菜根腫病的防治研究意義重大。蘿卜作為油菜的近緣種，有研究證明其對根腫病的抗性要高于甘藍和白菜，通過抗病性鑒定，篩選出優良的抗病蘿卜品種，進而通過有性雜交和子房培養方法，結合形態學、細胞學及分子檢測技術，將油菜近緣種蘿卜的抗根腫病基因導入到油菜中，以期獲得具有免疫或高抗根腫病的中間材料，進而拓寬甘藍型油菜的根腫抗病性遺傳基礎，為應對油菜根腫病抗性基因單一帶來的抗性易喪失問題提供更多可供選擇利用的種質資源。