D-二聚體及FIB 對ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者無進展生存期的預測價值

于海洋，潘躍銀

（安徽醫科大學附屬省立醫院腫瘤內科，安徽 合肥 230001）

肺癌（lung cancer）是我國最常見且致死率最高的惡性腫瘤，其中又以肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）所占比例最高，5 年生存率僅為4%～17%[1]。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是LUAD 的重要分子靶點，3%～5%的非小細胞肺癌患者存在ALK 基因重排[2]。克唑替尼是一種腺苷三磷酸競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可以通過靶向抑制ALK，進而發揮遏制腫瘤進展的作用[3]。然而，服用克唑替尼治療的患者大多會在1 年內產生耐藥性[4]，因此有必要尋找一個簡便的指標預測患者的治療效果。D-二聚體（D-dimer，D-D）是由凝血系統激活形成的交聯纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）的裂解產物，是凝血系統異常亢進的信號[5]。研究表明，血漿中D-D 的水平對結直腸癌[6]、卵巢癌[7]和非小細胞肺癌[8]患者的治療效果均具有一定預測價值。本研究通過Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫中ALK 陽性肺癌患者克唑替尼耐藥前原發灶和耐藥后肝轉移灶之間的轉錄組數據進行潛在機制的探索，隨后通過回顧性收集臨床數據來分析D-D 及FIB 水平對ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）預測作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 轉錄組資料 下載來自GEO 數據庫中編號為GSE125864 數據集的轉錄組數據和臨床信息，應用R 語言對GEO 數據庫中ALK 陽性肺癌患者克唑替尼耐藥前原發灶和耐藥后肝轉移灶之間的轉錄組數據的基因探針、名稱、表達量進行預處理，并同時下載基因表達譜原始數據及臨床數據以便進行生存分析。

1.2 臨床資料 隨后收集安徽醫科大學附屬省立醫院2014 年7 月-2020 年7 月122 例診斷為ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、臨床分期、轉移部位、治療線數、紅細胞（red blood cell，RBC）數值、白細胞（white blood cell，WBC）數值、血小板（platelet，PLT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、國際標準化比率（international normalized ratio，INR/PT-INR）、部分活化凝血酶原時間（active partial thromboplastin time，APTT）、FIB、D-D，并從患者首次服用克唑替尼的時間開始進行隨訪，隨訪日期截止到2020 年12 月，PFS 定義為從患者開始服藥至發生疾病進展或其他任何原因發生死亡的時間。納入標準：①經病理學和或組織學診斷為ALK 陽性的肺癌患者；②服用克唑替尼時間不少于1 個月；③依據國際抗癌聯盟肺癌TNM 分期為Ⅲ或Ⅳ期；排除標準：治療前存在明顯肝、腎功能損害、凝血障礙和或其他嚴重身心疾病。本研究經醫院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 差異基因分析 通過R 語言（3.63 版）DEseq2軟件包進行差異基因分析，設置原發組作為參考組，肝轉移灶組作為實驗組，參數設置log FoldChange=1，P＜0.05。

1.3.2 核心基因篩選 基于在線生物信息學在線數據庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進行通路富集分析；Cytoscape 軟件通過MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 種計算方式篩選關鍵樞紐（Hub）基因。

1.3.3 核心基因生存分析 GEPIA 在線生存分析工具（廣泛應用的腫瘤TCGA 數據庫的挖掘網站http://gepia2.cancer-pku.cn/）用于繪制關鍵Hub 基因的表達量與患者預后總生存期（overall survival，OS）相關的生存曲線。生存分析設置：①癌癥類型：肺腺癌和肺鱗癌；②方法：OS；③分組依據：基因表達中位值。

1.3.4 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 R 軟件（3.63 版）中內置的“clusterProfiler”用于對差異分析中滿足篩選條件的差異基因進行KEGG 通路富集分析及可視化，并依據P值大小進行排序展示，篩序標準：P＜0.05。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0 及R 等統計學軟件進行臨床數據分析與繪圖。采用Kaplan-Meier 法對不同分組間進行生存分析并繪制PFS 曲線。根據治療前血液指標構建受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，用曲線下面積（area under curve，AUC）評價其診斷價值。計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗；相關分析采用Spearman 檢驗；單因素、多因素分析采用Cox 回歸分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異基因及通路富集分析 以原發病灶作為對照組，服用克唑替尼的配對肝轉移灶中180 個差異基因上調，170 個差異基因下調（圖1A）。對差異基因進行KEGG 通路富集分析顯示，基因主要富集于補體及凝血級途徑（圖1B）；對上述差異表達基因進行蛋白-蛋白互作網絡網絡分析，并將得到的結果通過cytohubba 軟件進行Hub 基因的篩選，為了排除單一算法產生的誤差，采用MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 種計算方式篩選Hub 基因，并對得到的結果取交集得到FGA、FGG、APOA1以及APOB 關鍵Hub 基因（圖2A）；通過對TCGA數據庫中的肺癌患者進行生存分析顯示，FGA 和FGG 低表達組的中位總生存時間長于高表達組（圖2B、2C）。FGA 和FGG 分別編碼FIB 的α 和γ 鏈，FIB 的部分裂解產物為D-D。

圖1 克唑替尼耐藥轉移組織與原發組織中差異基因比較

圖2 核心基因及其生存分析

2.2 臨床數據分析

2.2.1 一般資料 共納入122 例ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者，具體臨床特征見表1。

表1 患者臨床特征（n，%）

2.2.2 預測價值分析 根據平均PFS 值評估基線血液參數值的ROC 曲線（狀態變量：PFS=17 個月）。以RBC、WBC、PLT、PT、PT-INR、APTT、TT、FIB、D-D為基線數據，ROC 曲線分析顯示，FIB、D-D 對PFS有良好的預測作用（AUC=0.798、0.906），FIB 的Cutoff 值為3.165（敏感度為88.20%，特異度為63.00%），D-D 的Cut-off 值為0.655（敏感度為81.60%，特異度為84.80%），見圖3。

圖3 治療前血液參數的ROC 曲線

2.2.3 Kaplan-Meier 生存分析 Kaplan-Meier 分析顯示顯示，122 例患者中低WBC 組的PFS 長于高WBC 組；低PT 組的PFS 長于高PT 組；低PT-INR組的PFS 長于高PT-INR 組；高TT 組的PFS 長于低PT-INR 組；低FIB、D-D 組的PFS 長于高FIB、D-D 組（P＜0.05），而其他血液參數組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析

圖4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析（續）

2.2.4 單因素及多因素分析 單因素Cox 回歸分析顯示，PT、PT-INR、FIB、D-D 與PFS 相關，見表2。多因素Cox 回歸分析顯示，D-D 和FIB 水平可作為評估ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者PFS 獨立預測因子，見表3。

表2 單因素Cox 回歸分析

表2（續）

表3 多因素Cox 回歸分析

3 討論

D-D 廣泛應用于血液系統疾病的診治中，包括血栓性疾病[9]、心血管疾病[10，11]治療結局的預測。既往關于癌癥與凝血因素的相關性研究表明，血漿中D-D 及FIB 的水平對結直腸癌[6]、卵巢癌[7]、肺癌[12，13]、尿路上皮癌[14]以及乳腺癌[15]等多種癌癥患者的治療效果及預后具有一定預測價值。然而大多數研究多集中在整個癌癥種類上，而忽略了不同癌種的分子分型及單獨的靶向藥物治療。

惡性腫瘤細胞中纖維蛋白溶解活性較高，且伴有大量FIB 激活物分泌，致使局部纖維蛋白溶解，從而引起血漿中D-D 與FIB 含量水平升高。研究顯示[16]，肺癌患者常伴隨凝血-纖溶功能異常，凝血纖溶系統的激活直接參與腫瘤的發展進程。Gieseler F 等[17]研究表明，肺癌細胞不僅能激活內皮細胞表達凝血因子，也能被其它細胞因子活化釋放組織因子，從而活化外源性的凝血纖維蛋白溶解通路，而凝血纖維蛋白溶解系統異常又可進一步導致腫瘤基質形成和血管生成。一項有關于腫瘤與高凝狀態作用的研究報道[18]，腫瘤患者預防用抗凝劑可取得一定的生存獲益。Klerk CPW 等[19]研究表明，皮下注射低分子肝素的短期療程有利于晚期惡性腫瘤患者的生存獲益。在小細胞肺癌患者的治療中，聯合使用低分子量的肝素可使患者獲得更佳的抗腫瘤效果[20]。這些關于凝血狀態異常與腫瘤治療的研究表明，凝血機制的異常激活或可導致腫瘤患者的進展和較差的預后，通過聯用抗凝藥物或可在一定程度上改善患者的治療效果，延長患者生存時間。

Wang X 等[21]研究發現，編碼FIB α 鏈的FGA與編碼FIB γ 鏈的FGB 過表達或可導致機體高凝狀態的產生。本研究中Hub 基因的篩選和基因預后分析表明，核心基因FGA 與FGG 的高表達與肺癌的不良預后相關。此外，通過收集并分析接受克唑替尼治療ALK 陽性患者的治療前血液參數和臨床信息，結果發現122 例患者中低WBC 組的PFS 長于高WBC 組；低PT 組的PFS 長于高PT 組；低PTINR 組的PFS 長于高PT-INR 組；高TT 組的PFS 長于低PT-INR 組；低FIB、D-D 組的PFS 長于高FIB、D-D 組（P＜0.05），而其他血液參數組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；且單因素Cox 回歸分析顯示，PT、PT-INR、FIB、D-D 與PFS 相關；多因素Cox 回歸分析顯示，D-D 和FIB 水平可作為評估ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者PFS 獨立預測因子。以上研究結果提示，FIB 及D-D 水平對于ALK陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者治療效果及預后具有一定的預測價值。

綜上所述，治療前FIB 和D-D 高水平提示ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者治療效果及預后較差，且FGA、FGG 高表達可能是導致患者快速進展的潛在機制之一，有待進一步的功能學實驗驗證。