基于GEO 差異基因分析及網絡藥理學探究真人養臟湯治療活動性潰瘍性結腸炎的分子機制研究

尹世杰，王 躍，程麗敏

（1.黑龍江中醫藥大學第一臨床醫學院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院肛腸科，黑龍江 哈爾濱 150000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及結直腸黏膜的淺表性、非特異性炎癥性疾病，一般與克羅恩病（Crohn's disease，CD）統稱為炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）。UC 臨床特點主要為腹痛、大便次數增多、便中常見粘液膿血、反復發作；其病變部位以直腸和乙狀結腸為主；病理上主要限于黏膜與黏膜下層，表現為黏膜水腫、充血、糜爛和潰瘍；少數患者出現腸外表現如：骨關節、皮膚、眼、肝膽等[1]。據現有流行病學調查所示[2]，該病目前在我國呈現逐年上升趨勢，可能與人民生活飲食習慣的改變及胃腸鏡檢查的普及有關。UC 多發于20～49 歲年齡段，男女發病率差異不明顯，為1.01～1.3∶1。UC 中醫多歸于“腸澼”“痢疾”“大瘕泄”等范疇。現在臨床上針對本病的主要治療方法包括氨基水楊酸制劑、糖皮質激素、生物制劑、辯證使用中藥湯劑、中藥保留灌腸、針灸等，中西結合治療常取得不錯的療效[3]。真人養臟湯出自《太平惠民和劑局方》“治大人小兒腸胃虛弱，冷熱不調，臟腑受寒，下痢赤白，或便膿血……”其組成為人參、當歸、白術、肉豆蔻、肉桂、甘草、白芍、木香、訶子、罌粟殼；縱觀全方，以澀為主，兼顧脾腎，標本兼治[4]。本研究利用GEO 數據庫及網絡藥理等生信學分析，構建其內在“藥物-化合物-靶點”網絡，并進行相關富集分析，預測此方對治療活動性UC 的潛在靶點及作用機制，以期為以后的臨床研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 GEO 差異基因獲取 從GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）以“ulcerative colitis”為關鍵詞檢索，過濾條件組織中勾選Homo、研究類型中勾選Expression profiling by array、時間設置為近5年；選擇成年UC 患者及健康者均超過10 例的樣本，使用R 程序中的程輯包“BiocManager”“GEOquory”下載并讀取其數據：GSE65114、GPL16686，完成分組、基因ID 轉換等操作后，對每個基因給定一系列的陣列來擬合線性模型，應用“limma”包對每個基因進行逐一比對，在Pvalue＜0.05 的基因中，如果logFC＞1.0（FC 即為差異倍數）,則為上調基因，logFC＜-1.0，則為下調基因；使用“ggplot2”包繪制差異基因火山圖及較為顯著基因熱圖。

1.2 真人養臟湯中成份及在差異基因中的靶點篩選從TCMSP 中分別以真人養臟湯中組成為關鍵詞檢索，設置口服生物利用度（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18），得到有效成份，再搜索其對應的靶點，然后在UniProt（https://www.uniprot.org/）數據庫中查詢所有人類基因名稱，運用R 語言merge 函數對其進行匹配，得到其成份所對應的靶點；繪制venn 圖（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），得到真人養臟湯在差異基因這種對應的靶點。

1.3 “藥物-成分-靶點”調控網絡、PPI 的構建 運用Cytocape3.7.2 軟件將所得靶點構建“藥物-成分-靶點”調控網絡。在STRING 數據庫中檢索的到原始PPI 網絡，并以度中心性、介度中心性均大于中位數為條件刷選，得到核心靶點。

1.4 真人養臟湯治療UC 的GO、KEGG 分析 應用R語言中“BiocManager”程輯包將所得交集靶點完成ID 轉化，將P值及矯正后的P值均設置為0.05，進行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，保存富集結果并選取生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）各自前10 位、富集前20 位通路繪圖。

2 結果

2.1 GEO 差異基因獲取 下載基因表達數據為GSE87466，包含21 例正常成年人和87 例UC 患者，探針平臺為GPL13158[HT_HG-U133_Plus_PM]Affymetrix HT HG-U133+PMArrayPlate，共獲得上調基因368 個，下調基因729 個，差異基因火山圖見圖1，歸一化處理差異倍數后基于P值前10 位的上、下調基因見熱圖，見圖2。

圖1 差異基因火山圖

圖2 差異基因熱圖

2.2 真人養臟湯中成份及在差異基因中的靶點篩選本方中共檢索得到成分141 個，部分見表1。對應靶點258 個，通過Bioinfogp 網站繪制venn 圖見圖3，得到真人養臟湯在差異基因中發揮作用的靶點為36 個，對這36 個靶點完成ID 轉化。

表1 部分有效成分

圖3 VENN 圖及交集基因PPI

2.3 “藥物-化合物-靶點”調控網絡、PPI 的構建 所得36 個靶點對應92 個有效成份，其中來自白芍1個、當歸1 個、甘草79 個、訶子1 個、木香3 個、人參8 個、肉豆蔻3 個、肉桂3 個。白術及罌粟殼并沒有在本次研究中發現參與差異基因的靶點，部分成份可來自不同藥材，在Cytoscape 軟件構建的調控網絡見圖4；度值排名前3 的藥物成份為槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、油酸（oleic acid）。排名前3 的靶點為誘導型一氧化氮合酶（NOS2）、過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）、免疫球蛋白重鏈常組1（IGHG1）。所得36 個靶點在數據庫中互作網絡見圖2，篩選后獲得靶點10 個，分別為白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、趨化因子2（CCL2）、白細胞介素1B（IL-1B）、血管細胞黏附因子1（VCAM1）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、重組人分泌型磷蛋白1（SPP1）、血管內皮生長因子受體（KDR）。這些靶點可能是真人養臟湯治療UC 的關鍵靶點。

圖4 “藥物-成份-靶點”網絡

2.4 真人養臟湯治療UC 的GO、KEGG 分析 對36個交集基因進行分析后，共篩選得到880 個GO 條目（P＜0.05）和45 條KEGG 通路（P＜0.05），選取排名前10 的條目及前30 的通路的繪制柱狀圖，見圖5、圖6。可以看到基因主要富集在對脂多糖及來源細菌的分子反應，細胞外基質組織的生物過程，膜閥、膜微區、質膜的外側等細胞組分，細胞因子活性、受體配體活動、信號受體激活因子活性等分子功能。而從KEGG 富集結果來看，這些靶點主要富集在TNF、IL-17、NF-kB、Toll 樣受體等信號通路。此外，其結果表明這些靶點可能參與糖尿病并發癥、粥樣硬化、類風濕性關節炎等疾病的病理過程。

圖5 基因富集分析

圖6 通路富集分析

3 討論

UC 是一種易復發的IBD，以黏膜炎癥為特征，始于遠端，可向近端擴散，累及整個結腸，其發病率逐年上升，病因涉及環境、免疫系統、腸道微生物群和遺傳易感性之間的相互作用[5]。UC 現為血性腹瀉、頻發、腹痛、疲勞和大便失禁。蒙特利爾分類根據疾病的最大范圍將UC 患者分為E1（直腸炎：僅限于直腸疾病）、E2（左側疾病：脾彎曲遠端）、E3（廣泛結腸炎：疾病延伸至脾彎曲近端）。左側疾病或廣泛結腸炎患者使用藥物、結腸切除和結直腸癌的風險較高。除疾病本身外，UC 患者轉化為結腸惡性腫瘤的主要危險因素包括：病程、活躍的內窺鏡檢查或組織炎癥、存在狹窄或炎癥后息肉、結直腸癌家族史及相關的原發性硬化性膽管炎病史（一種慢性炎癥性膽管疾病，影響3%～7%的UC 患者）。UC 的其他腸外表現包括：貧血、關節病（中軸性或外周性）、皮膚（結節性紅斑或壞疽膿皮病）和眼部表現（前葡萄膜炎或上皮炎）等。治療的目的是實現癥狀的快速緩解、粘膜愈合和患者生活質量的改善。5-氨基水楊酸藥物仍然是輕中度疾病的一線治療藥物。如果對這些藥物的反應不佳，可能需要升級為免疫抑制藥物和生物制品。盡管已有較好的藥物治療，但仍有一部分患者需要手術治療。中醫在治療UC 上有其獨特的優勢，湯藥口服、保留灌腸、針灸、穴位貼敷可有效緩解患者癥狀，促進腸粘膜潰瘍面愈合，提高患者生活質量。真人養臟湯全方配伍嚴謹、攻補兼施、標本兼治，臨床中常作為治療泄瀉日久脾腎虧虛基礎方。

從本次研究最終結果來看，槲皮素、山奈酚、油酸涉及靶點比較密集。槲皮素化學式為C15H10O7，大量研究表明槲皮素通過抑制炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、環氧化酶（COX-2）等表達量而達到抗炎癥的效果[6，7]。有動物實驗發現[8]，槲皮素能保護大鼠腸粘膜微血管內皮細胞免受肽聚糖導致的細胞炎性損傷。山奈酚的化學式是C15H10O6，有實驗表明[9]，山奈酚可有效降低UC 模型鼠體內內毒素水平，且能抑制了TLR4 等炎癥信號通路的表達，而TLR4 等正是UC病程中的核心通路之一。油酸化學式為C18H34O2，廣泛存在于動植物之中，目前并無明確證據可證明其緩解UC 癥狀，但含油酸膳食可以使腸道抗炎細菌屬更加豐富。與UC 相關的主要指標包括：疾病活動性指數、結腸炎大體評分、結腸黏膜上皮病變、結腸炎癥細胞密度、結腸髓過氧化物酶滴度、促炎細胞因子（IL-17、干擾素-γ）均降低[10，11]。

從PPI 網絡結果看，IL-6、TNF、MMP9、CCL2、IL-1B、VCAM1、ICAM1、PPARG、SPP1、KDR 可能即為真人養臟湯治療UC 的關鍵靶點，IL-6、IL-1B、TNF 在UC 的發病過程發揮關鍵作用，當淋巴細胞受到腸道各種理化因素的刺激，便會分化出多種T細胞亞群及細胞因子，諸如IL-6 等炎性因子便會將信號傳導，從而誘發炎癥[12]。MMP9 是金屬蛋白酶的一種，主要通過參與細胞外基質的局部蛋白分解和白細胞遷移過程，進而影響腫瘤的侵襲和轉移。有研究表明在UC 患者中，尤其是金屬蛋白酶表達的增加與確定疾病進展的組織病理學標志物之間存在著顯著的相關性，另有研究表明[13-15]，UC 患者腸組織中MMP9 表達水平明顯高于正常人，且應用酶聯免疫法定量測定患者糞便中MMP9 表達量具有高敏感性和特異性，但根據最近的臨床試驗結果顯示，給UC患者應用安得列西單抗（能夠拮抗MMP9）8 周后，與安慰劑組對比，并沒有出現明顯臨床癥狀緩解，是否應用MMP9 拮抗劑治療UC 仍有待商榷。CCL2 作為C-C 趨化因子受體CCR2 的配體,通過結合和激活CCR2 發出信號，并誘導強烈的趨化反應和細胞內鈣離子的動員,尤其對單核細胞和嗜堿性粒細胞作用比較活躍；且CLL2 為UC 自噬中樞因子，當腸道處于炎癥狀態時，CCL2 表達量上升[16]。VCAM1、ICAM1 均在白細胞免疫反應和白細胞遷移到炎癥部位中發揮重要的信號傳導功能，UC 患者的粘附因子表達量顯著增高，現有部分臨床試驗表明抗粘附因子藥物PF-00547659（一種人單克隆抗體，可選擇性減少淋巴細胞募集至腸道）能有效緩解中重度UC患者癥狀，但安全性仍需進一步評估[17，18]。

重組人過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）是脂肪酸代謝、氧化和胰島素增敏的重要基因，已被證明是5-ASA 發揮抗炎和抗氧化作用的關鍵受體[19]。相關研究發現[20，21]，PPARG 在腸道炎癥和纖維化中起關鍵作用，當PPARG 激活時將減少促炎細胞因子如TNF-α、IL-6 的產生，并抑制NFkB、AP-1、ICAM1、MMP9 等表達，且目前已有動物試驗應用通過運用α-比沙布洛爾來抑制MAPK 信號傳導和刺激PPAR-γ 表達以減輕結腸炎癥。分泌型磷蛋白1（SPP1）是一種分泌型多功能糖蛋白，一般在骨組織中表達，即骨橋蛋白（OPN）；由活化的淋巴細胞和巨噬細胞釋放，參與增強干擾素γ 和IL-12的產生，并減少IL-10 的產生，其在諸多免疫反應中也發揮重要功能。有研究發現[22，23]，IBD 患者的血漿OPN 水平要高于對照組，并且與多種炎癥因子存在顯著相關性。KDR 可與血管內皮生長因子（VEGF）結合，在血管和淋巴管生成發育、血管通透性和胚胎造血的調節中發揮重要作用，并誘導巨噬細胞和小膠質細胞產生炎癥因子，在一些炎癥性疾病視如網膜病炎、膿毒癥均可以發現其大量表達。有研究在探究沙利度胺對實驗性結腸炎模型小鼠影響時發現[24-26]，實驗組VEGF 表達降低，腸粘膜損傷癥狀較空白對照組明顯緩解，這也說明了通過抑制KDR/VEGF 減少血管生成以緩解IBD 炎癥反應或許是可行的，但仍需要進一步研究。

從KEGG 富集分析結果來看，真人養臟湯治療UC 主要涉及炎癥及免疫反應相關通路，其中較為顯著的是TNF、IL-17、NF-kB、Toll 樣受體信號通路。TNF 在UC 病理過程中發揮重要作用，抗TNF已成為治療UC 的重要方法[27]。IL-17 在腸道炎性反應中具有雙向調節作用，有動物實驗表明IL-17 在小鼠模型中有保護、加劇雙重作用，同時有兩項隨機對照試驗明確指出，阻斷IL-17/IL-17R 也許會干擾IL-17 對于腸道的保護作用[28]。NF-κB 信號通路是UC 的關鍵通路之一，當胞質內的NF-κB 被激活時便會刺激TNF-α、IL-1β 等多種炎癥因子和介質的分泌，直接影響腸道炎性反應。有研究使用蘇木素-伊紅染色測定UC 患者結腸組織，發現NF-κB 的表達水平與患者腸道癥狀、血沉、C 反應蛋白呈現正相關，中醫藥可通過抑制此通路表達以減輕UC 癥狀，應用自擬經驗方可有效改善實驗性結腸炎模型小鼠的癥狀，抑制病理損傷，降低TLR4/MyD88/NF-κB相關蛋白的表達量[29-31]。Toll 樣受體信號通路（TLRs）是UC 典型免疫反應通路之一，當Toll 樣受體激活，將產生促炎細胞因子和趨化因子導致免疫系統失衡，從而誘發UC，目前通過抑制TLRs 來治療免疫性疾病已在臨床工作中應用[32]。

上述靶點、通路都不是獨立存在的，它們共同影響著UC 的發病、轉歸，可以通過抑制部分受體的表達來緩解腸道炎癥反應；但亦有部分靶點存在雙向作用，若抑制恐將適得其反。從上述研究可以看出，真人養臟湯在治療UC 上有其優勢，涉及差異基因中多個靶點，為中藥復方治療UC 提供新的參考依據，但本研究仍有諸多不足，需進一步完善。