TP63對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞吉非替尼耐藥性及DSC3/DSG3基因表達(dá)的影響

楊穎 成薇婷 何肇晴 汪銳 李婧

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，湖北 武漢 430022)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于其惡性程度高，預(yù)后差，5年生存率約15%，其中肺腺癌為最主要的病理類(lèi)型。吉非替尼為表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)，常用于NSCLC患者的治療，可提高患者生存率，然而多數(shù)患者在治療一段時(shí)間(9.2～14.7個(gè)月)后會(huì)產(chǎn)生耐藥性〔1,2〕。因此，探究NSCLC的耐藥機(jī)制，有助于提高癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。腫瘤蛋白(TP)63是p53的同源基因，可參與調(diào)控干細(xì)胞的分化、組織的生長(zhǎng)發(fā)育及腫瘤的發(fā)生等，在表皮發(fā)育與衰老中起重要作用〔3〕。有研究表明，TP63不僅參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，TP63的異常表達(dá)也與腫瘤細(xì)胞的耐藥性有關(guān)〔4〕。但TP63是否參與NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥性尚不清楚。橋粒芯膠蛋白(DSC)3是參與細(xì)胞間橋連接的鈣結(jié)合膜糖蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞黏附作用，在NSCLC等多種腫瘤中均有表達(dá)〔5〕。橋粒芯糖蛋白(DSG)3屬于黏附分子中的鈣黏素超家族的成員，在NSCLC中表達(dá)水平升高，在肺鱗癌中陽(yáng)性表達(dá)高于肺腺癌，可作為區(qū)分肺鱗癌與肺腺癌的標(biāo)志物〔6〕。本研究探索TP63對(duì)人NSCLC細(xì)胞(PC9)吉非替尼耐藥及DSC3/DSG3表達(dá)的影響，以期為臨床探索克服NSCLC對(duì)吉非替尼耐藥性的有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 人NSCLC吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9、吉非替尼耐藥株P(guān)C9/GR購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；吉非替尼購(gòu)于美國(guó)Selleckchem公司；TP63干擾RNA序列購(gòu)于蘇州吉瑪基因公司；TP63、DSG3、DSC3 及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成；PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自杭州四季青生物科技公司；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；兔抗人TP63、DSG3、DSC3、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將PC9與PC9/GR細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取耐藥細(xì)胞 PC9/GR消化接種于24孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，每孔接種200 μl，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA，對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染，其余兩組分別轉(zhuǎn)染TP63干擾RNA(TP63-siRNA)和陰性對(duì)照(NC-siRNA)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)將TP63-siRNA和NC-siRNA轉(zhuǎn)染PC9/GR細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選。

1.2.2TP63-siRNA轉(zhuǎn)染后 PC9/GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的半數(shù)抑制濃度 收集對(duì)照組、TP63-siRNA和NC-siRNA組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC9/GR細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，分別加入吉非替尼使其終濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，同時(shí)設(shè)置二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8液，孵育30 min后，測(cè)定450 nm處吸光度值，計(jì)算各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TP63、DSG3、DSC3 mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR檢測(cè)PC9與各組細(xì)胞中TP63、DSG3、DSC3相對(duì)表達(dá)量，使用RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分別計(jì)算各RNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列：TP63上游引物5′-3′：GGACCAGCAGATTCAGAACGG；下游5′-3′：AGG ACA CGTCGAAACTGTGCDSG3上游引物5′-3′：GGAGGAACAGACTAACAGGC；下游5′-3′：ACCATCAGGAGGGCCAGAGADSC3上游引物5′-3′：GAAAGTAGTAG ACCTGGTACT；下游5′-3′：ACGCCTGTGCTGGGATGCAGAPDH上游引物5′-3′：GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG；下游5′-3′：TGTGCCGTTGAATTTGCCGTGAGTGG。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，分別于24、48、72 h時(shí)向每孔加入100 μl濃度為10%的CCK8的反應(yīng)液，于450 nm酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl PI染液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板中，用無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔接種約2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24后，用200 μl的槍頭在各孔垂直劃痕，培養(yǎng)48 h后，顯微鏡觀察拍照，測(cè)量劃痕距離，計(jì)算愈合率。愈合率(%)=〔(愈合前劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距離-愈合后劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距離)/愈合前劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距離〕×100%

1.2.7Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 將融化的基質(zhì)膠鋪于24孔Transwell板上室中，待基質(zhì)膠凝固，取對(duì)照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，每孔接種3×105個(gè)細(xì)胞，下室加入10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察拍照，并計(jì)算穿模細(xì)胞數(shù)。

1.2.8Western印跡檢測(cè)TP63、DSG3、DSC3蛋白表達(dá) 取PC9與各組細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，加入裂解液提取總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，使用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人TP63、DSG3、DSC3單克隆抗體和β-actin，37℃孵育2 h后，TBST洗滌3次，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PC9細(xì)胞和PC9/GR細(xì)胞中TP63的表達(dá) 與PC9細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞PC9/GR中TP63 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)TP63蛋白表達(dá)

表1 PC9、 PC9/GR細(xì)胞TP63表達(dá)

2.2干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞IC50值的影響 與對(duì)照組和NC-siRNA組相比，TP63-siRNA組 PC9/GR細(xì)胞IC50值顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞增殖與凋亡的影響 與對(duì)照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組PC9/GR細(xì)胞48、72 h增殖顯著下降，凋亡率顯著升高(P<0.05)；說(shuō)明干擾TP63的表達(dá)顯著抑制PC9/GR細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)表2、表3、圖2。

2.4干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組 PC9/GR細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著下降(P<0.05)；說(shuō)明干擾TP63的表達(dá)可顯著抑制 PC9/GR細(xì)胞遷移、侵襲行為。見(jiàn)表2、圖3、4。

2.5干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞TP63、DSC3、DSG3 mRNA的影響 與對(duì)照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組TP63、DSC3、DSG3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞IC50細(xì)胞凋亡率、遷移、侵襲及TP63、DSC3、DSG3 mRNA比較

表3 干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞增殖影響

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組PC9/GR細(xì)胞凋亡

圖3 各組PC9/GR細(xì)胞遷移(×100)

圖4 各組PC9/GR細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

2.6干擾TP63的表達(dá)對(duì)PC9/GR細(xì)胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組TP63、DSC3、DSG3 蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5、表4。

1～3:對(duì)照組、NC-siRNA組、TP63-siRNA組圖5 Western印跡檢測(cè)各組TP63、DSC3、DSG3蛋白表達(dá)

表4 各組細(xì)胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表達(dá)情況

3 討 論

NSCLC由于潛伏期長(zhǎng)，患者確診時(shí)多為中晚期，放化療是其主要治療方式，吉非替尼是常用于治療NSCLC的分子靶向藥物，然而EGFR基因突變會(huì)導(dǎo)致NSCLC吉非替尼耐藥，歐美有10%～15%肺腺癌患者發(fā)生突變，而在亞洲EGFR突變可高達(dá)40%～50%，藥物耐受成為EGFR-TKI治療的瓶頸，也是導(dǎo)致NSCLC化療失敗的主要原因〔7,8〕。

TP63是p53家族成員的核轉(zhuǎn)錄因子，與p53具有同源性，在食管鱗癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中均有表達(dá)，發(fā)揮抑癌或促癌作用〔9,10〕。TP63基因可編碼TAp63、ΔNp63等兩大類(lèi)型蛋白，其中TAp63與p53的功能類(lèi)似，可與p53的DNA結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用；ΔNp63可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TAp63的結(jié)合位點(diǎn)，降低p53的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔11,12〕。鄭雪等〔13〕研究表明，宮頸癌中TP63 基因啟動(dòng)子 DNA 甲基化抑制其表達(dá)，且與腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期相關(guān)。研究表明〔14〕，TP63在NSCLC表達(dá)水平升高，且肺鱗癌中TP63蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于肺腺癌。本研究結(jié)果提示TP63與PC9細(xì)胞耐藥有關(guān)，推測(cè)TP63可能在PC9/GR中發(fā)揮ΔNp63的促癌特性。Patel等〔4〕研究表明，在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑耐藥的黑色素瘤細(xì)胞中TP63表達(dá)上調(diào)，通過(guò)用鼠雙微基因(MDM)2抑制劑Nutlin-3A的治療可降低TP63表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、克服耐藥性。本研究結(jié)果表明干擾TP63表達(dá)，可增加PC9/GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，TP63可能是PC9細(xì)胞吉非替尼耐藥的標(biāo)志物，然而其具體作用機(jī)制尚不清楚。

DSC3和DSG3都屬于鈣黏蛋白基因超家族，主要在細(xì)胞膜表面發(fā)揮作用，與細(xì)胞黏附、表皮細(xì)胞的定位有關(guān)。研究表明〔15〕，DSC3在前列腺癌組織與細(xì)胞系中中低表達(dá)或甲基化，且與患者預(yù)后不良有關(guān)。另外，DSC3的表達(dá)受P53途徑的調(diào)節(jié)，其甲基化與結(jié)腸癌患者預(yù)后有關(guān)〔16〕。Dong等〔17〕研究表明，DSG3在NSCLC中高表達(dá)，且肺鱗癌患者DSG3相對(duì)表達(dá)水平高于肺腺癌患者，其高表達(dá)與肺鱗癌患者不良預(yù)后有關(guān)。另有研究表明〔18〕，直腸腺癌中DSG3表達(dá)水平升高，且與患者預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果提示干擾TP63表達(dá)，可下調(diào)細(xì)胞DSC3、DSG3表達(dá)。DSG3可通過(guò)DSG3-plakoglobin-TCF/LEF 通路促進(jìn)頭頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與侵襲，沉默DSG3表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞停留在G0/G1期〔19〕，表明下調(diào)DSG3表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖，因此，本研究推測(cè)，干擾TP63表達(dá)水平可顯著降低PC9/GR細(xì)胞增殖、遷移、侵襲行為可能與下調(diào)DSC3和DSG3表達(dá)有關(guān)。

綜上，TP63在PC9/GR細(xì)胞中高表達(dá)，干擾TP63表達(dá)可抑制 PC9/GR 細(xì)胞增殖、遷移與侵襲行為，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)PC9/GR對(duì)吉非替尼的耐藥性，可能與下調(diào)DSC3/DSG3表達(dá)有關(guān)。然而，其具體作用機(jī)制仍需要做進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。