經典組蛋白去乙酰化酶在中樞神經系統中作用

于美華 包金風

(內蒙古醫科大學基礎醫學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

表觀遺傳學是指不改變脫氧核糖核酸(DNA)序列而產生的可遺傳變化，其在調節基因組功能中發揮關鍵作用，影響基因表達和(或)轉錄，從而調控機體的生長、發育及病理過程〔1〕。表觀遺傳學修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼核糖核酸(RNA)等。組蛋白乙酰化核酸修飾是調節DNA功能的重要方式，近年來，研究表明組蛋白乙酰化在神經系統疾病發生發展中起重要作用〔2〕。

1 組蛋白乙酰化和去乙酰化

染色質由DNA和組蛋白等組成，其基本結構單位是核小體，它是由4個基本組蛋白(H3，H4，H2A和H2B)組成的八聚體。每個組蛋白八聚體都被147個堿基對的DNA包裹〔3〕。染色質是一種非常活躍的結構，它能夠響應DNA的各種信號及通過轉錄過程調控基因表達。染色質對轉錄的影響受多種酶調控，這些酶會“生成”“讀取”和“擦除”各種表觀遺傳修飾，從而促進或抑制基因轉錄，如組蛋白乙酰化轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)等，這些酶對基因轉錄調節起重要作用。

組蛋白乙酰化是指在HATs作用下組蛋白賴氨酸的尾端上添加乙酰基，使組蛋白與DNA的結合位點變得松弛，從而改變染色體轉錄活性。乙酰化修飾參與基因轉錄、蛋白降解和細胞代謝等多個細胞過程〔4〕。HDACs則去除乙酰基，正常情況下與HATs和HDACs維持組蛋白乙酰化及去乙酰化動態平衡〔5〕。HDACs抑制劑(HDACi)通過抑制HDACs活性調控基因表達，在神經系統疾病治療中具有潛在臨床價值〔6〕。

2 HDACs分類

目前已知的HDACs共有18種，根據它們與酵母組蛋白脫乙酰基酶的同源性將其分為四類：Ⅰ類HDACs (HDAC1，2，3和 8)；Ⅱ類HDACs( Ⅱa：HDAC4、5、7和9；Ⅱb：HDAC6和10)；Ⅲ類通常稱為沉默信息調節因子(SIRT)，包含SIRT1-7；Ⅳ類僅包含一種非典型HDAC同工型11。其中Ⅲ類屬于依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的沉默調節蛋白，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類屬于依賴Zn2+的HDACs，被稱為經典HDACs〔7〕。

3 HDACs與中樞神經系統

神經發生指新的神經元生成過程，包括神經干細胞(NSCs)增殖分裂成為祖細胞，并逐漸向功能區域遷移、不斷發生可塑性變化并與其他神經元建立突觸聯系從而產生成熟神經元的一個復雜的過程。此過程涉及大量特定基因的調控，而染色質結構調節是轉錄的調控關鍵，如對其進行修飾以促進或阻止轉錄因子和RNA聚合酶復合物與其結合。HDACs是調節染色質結構的一類酶，HDACs除了改變染色質結構和組蛋白乙酰化導致基因轉錄改變外，HDACs還可使大量非組蛋白蛋白質脫乙酰化，如轉錄因子、結構蛋白、離子通道、受體和酶等〔5〕。其中，轉錄因子的乙酰化狀態會改變DNA結合特性和轉錄活性，而且，這些蛋白質的脫乙酰基可以對其功能、穩定性、亞細胞定位產生影響，并同時影響與它們相互作用的蛋白質。例如，研究表明HDAC1，2和3使絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸酶(MKP)1脫乙酰化，并且這種翻譯后修飾增加了MAPK和免疫信號傳導〔8〕。研究發現，組蛋白乙酰化和去乙酰化之間的平衡破壞可直接引起或導致神經發育障礙和神經精神疾病等〔9〕。研究表明HDACs參與和年齡相關的神經退變過程〔10〕。這意味著HDACs可以通過組蛋白去乙酰化和基因表達變化或通過其他機制發揮其神經毒性或神經保護作用。

3.1Ⅰ類HDACs Ⅰ類HDACs主要定位于細胞核，而HDAC3可定位于細胞質和細胞核。HDAC 8在平滑肌中表達，目前研究認為其對神經系統影響較少。而HDAC1、2、3在神經發育發生及病理過程具有重要作用。

3.1.1HDAC1和HDAC2 HDAC1和HDAC2具有高度同源性，對組蛋白表現出很高的酶促活性，不同的細胞類型中或對不同的刺激和信號傳導途徑作出反應時顯示出功能重疊和互補。皮層發育早期階段，兩種蛋白都在神經上皮細胞(NECs)和神經祖/前體細胞(NPC)中高表達〔11〕。出生后，HDAC1主要在神經膠質細胞中表達，而HDAC2主要在新皮層和其他大腦區域的成熟神經元中表達〔12〕。

HDAC1和HDAC2在調節胚胎干細胞(ESCs)和NSCs的增殖和神經分化中具有重要作用。研究發現，缺失HDAC1或HDAC2的小鼠腦部無明顯異常，然而，同時敲除小鼠NPC和星形膠質細胞中HDAC1和HDAC2，會在出生后第7天左右表現為嚴重的腦部發育異常或死亡，研究發現皮質、海馬和小腦在內的大腦區域的發育受到嚴重影響，NPC的增殖增加，但分化受損〔13〕。小鼠胚胎著床前敲除HDAC1或HDAC2不會影響胚胎形成，但同時敲除HDAC1和HDAC2則影響桑椹胚到囊胚的過渡從而致死〔14〕。這些結果也說明HDAC1和HDAC2具有功能上的互補和重疊。

HDAC1和HDAC2發揮神經毒性或神經保護作用取決于其細胞定位、組蛋白乙酰化及非組蛋白乙酰化作用。研究發現，使用小干擾RNA(siRNA)沉默HDAC1的人臍帶間充質干細胞移植治療腦外傷小鼠，可能通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路促進移植后神經元的遷移和神經分化，表現為神經發生增強、神經凋亡減少，并能減少海馬的氧化應激，從而提高腦外傷小鼠模型中人臍帶間充質干細胞移植的療效〔15〕。TAR DNA結合蛋白(TDP)-43是一種主要位于細胞核中DNA/RNA結合蛋白，研究發現，TDP-43蛋白錯疊可導致額顳葉變性(FTLD) 和肌萎縮性側索硬化癥(ALS)等多種神經退行性疾病。研究發現，HDAC1從核到胞質錯誤定位可誘導與TDP-43蛋白異常相關疾病神經細胞細胞周期異常和DNA損傷〔16〕。

HDAC1和HDAC2通過調節染色質修飾還參與突觸可塑性和記憶形成，并在與突觸可塑性有關的神經系統疾病發生和發展過程中起重要作用。Angelman綜合征是一種神經突觸發育障礙性疾病，其特征是母體遺傳的泛素蛋白連接酶(UB)E3A基因功能喪失導致嚴重的智力和發育缺陷。研究發現，在Angelman綜合征小鼠中，HDAC1和HDAC2蛋白水平均顯著升高，同時組蛋白H3/H4的乙酰化水平降低〔17〕。帕金森病(PD)受試者黑質小膠質細胞中HDAC2明顯上調，并伴隨多巴胺能神經元細胞的丟失〔18〕。通過敲低HDAC2可提高阿爾茨海默病(AD)CK-p25小鼠模型的突觸可塑性和記憶力〔11〕。這些研究表明HDAC2在神經退行性疾病的發生發展過程中起重要的作用。Abelson酪氨酸激酶(c-Abl)通過誘導HDAC2磷酸化，增加組蛋白H3脫乙酰基作用將HDAC2募集至突觸可塑性關鍵基因，如突觸結合蛋白、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基NR2a和谷氨酸受體(GluR)1的啟動子上，從而誘導轉錄抑制〔19〕。

3.1.2HDAC3 與其他Ⅰ類HDACs不同，HDAC3既定位于細胞核，又定位于細胞質。研究表明HDAC3是一種具有較強神經毒作用的蛋白。HDAC3是腦中表達水平最高的Ⅰ類HDACs，尤其在發育小鼠的腦中高表達，表明HDAC3與腦發育有關〔20〕。該基因在腦中特異性失活可誘發幼鼠活動過度、焦慮、嚴重的發育缺陷及早期死亡，Li等〔21〕推測這可能是HDAC3在大腦中的特異性缺失促進了過早的神經發生造成的，ESCs和NSCs在自我更新和分化之間處于動態平衡狀態，敲除HDAC3小鼠海馬中，NSCs細胞周期異常停滯并進行神經元分化，而神經發生促進基因如神經源分化因子(NeuroD)1轉錄增加。這些結果表明正常水平的HDAC3對于神經發育至關重要。

HDAC3可能通過抑制神經元存活所需的基因表達來促進神經變性。神經元PAS結構域蛋白(Npas)4和腦源性神經營養因子(BDNF)在腦發育和學習記憶相關突觸可塑性形成及神經退行性疾病中起關鍵作用〔22〕。研究發現，Npas4和BDNF都是HDAC3靶基因，使用腺病毒在皮質神經元中過表達HDAC3可抑制Npas4和BDNF啟動子活性，使其表達降低，給予HDAC3抑制劑RGFP-966處理則可使Npas4和BDNF表達上調〔23〕。故HDAC3神經毒作用可能部分通過降低Npas4和BDNF轉錄介導。

最近研究發現，HDAC3也是長期記憶形成和學習能力的關鍵負性調控因子。小鼠海馬CA1中HDAC3基因缺失或抑制能夠增強小鼠對物體定位的長期記憶，而 HDAC3 的高表達能促進神經元變性壞死〔24〕。敲除HDAC3可增加生物鐘基因Period(Per)1啟動子的乙酰化進而增加其表達。由于海馬Per1表達對于長期記憶形成起關鍵的作用，過表達Per1可改善與年齡有關的記憶障礙，而HDAC3的缺失可改善衰老小鼠記憶能力和突觸可塑性〔25〕。核受體亞家族4a組成員(Nr4a)2是記憶形成有關并能夠調節多種生物學過程的轉錄因子。HDAC3通過去乙酰化使Nr4a2啟動子的染色質處于封閉狀態而減少其表達，而Nr4a2能夠和Bdnf啟動子區域結合，從而促進長期記憶形成〔26〕。有研究發現，HDAC3在與可卡因相關的記憶消退有關的特定大腦區域中起作用〔27〕，HDAC3可能參與藥物依賴性的產生。利用HDAC3選擇性抑制劑RGFP-966抑制HDAC3可降低病理性tau磷酸化和乙酰化作用，降低腦和周圍區域的β-淀粉樣蛋白(Aβ)蛋白表達，增加周圍區域的Aβ降解，改善3xTg-AD模型小鼠的學習和記憶能力，并使許多與AD相關的基因正常化〔28〕。因此，選擇性HDAC3抑制劑可能有助于改善長期記憶和學習能力，這為未來AD等疾病藥物治療提供新的研究靶點。

3.2Ⅱa類HDACs HDAC Ⅱa具有在細胞核與細胞質之間穿梭的能力，一般情況下處于非磷酸化狀態，在特定信號因子作用下可被磷酸化，磷酸化后與轉錄因子相互作用而被募集到靶基因，發揮抑制基因轉錄的作用。肌細胞增強因子(MEF)2是神經系統重要的轉錄因子，研究表明，Ⅱa類HDACs都具有MEF2依賴性轉錄抑制作用。

3.2.1HDAC4 HDAC4在腦中廣泛表達，其中在小腦、海馬和嗅球中表達較高。在靜息狀態時，HDAC4主要在細胞質中，但HDAC4受鈣/鈣調蛋白依賴性激酶介導的磷酸化的調節下，抑制突觸活性或阻斷核鈣信號傳導可導致HDAC4在細胞核中集聚〔29〕，如在腦卒中和PD等疾病中已經觀察到神經元細胞核中HDAC4表達水平的升高，并與神經元死亡和疾病進展相關〔30，31〕。研究發現，HDAC4的核易位在缺血性腦病中具有保護作用〔28〕。因此，HDAC4的核聚集增多可促進神經元退化。血管內皮生長因子(VEGF)D是維持樹突結構的關鍵蛋白，HDAC4的核聚集可通過下調VEGFD的表達使樹突結構受損〔32〕。

近年來研究發現，HDAC4在腦中具有較少脫乙酰基酶活性。HDAC4通過與其他HDACs或其他調節蛋白的相互作用而發揮其作用。如亨廷頓病(HD)是由亨廷頓蛋白(HTT)外顯子內胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)重復次數增加引起的，這種擴增可產生具有聚谷氨酰胺(polyQ)殘基的突變蛋白(mHtt)，這種突變蛋白易于聚集，從而導致蛋白質錯疊，最終導致神經元功能障礙和細胞死亡。HDAC4能夠以polyQ依賴的方式與突變的mHtt相互作用增加mHtt聚集，同時，HDAC4基因敲低可改善了HD小鼠的病理特征〔33〕。

3.2.2HDAC5 HDAC5具有Ⅱa類特異性核質穿梭能力，也是關鍵的轉錄調節因子。 此外，鈣和蛋白激酶C依賴性HDAC5從細胞核向細胞質易位可導致組蛋白乙酰化增加，恢復促進神經元存活和軸突生長的基因轉錄，如激活轉錄因子(ATF)3〔29〕。這表明HDAC5的去乙酰化作用和核質穿梭能力在軸突再生中發揮重要作用。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度保守的絲氨酸(Ser)-蘇氨酸激酶，mTOR控制干細胞的發育，參與調節基因翻譯、細胞生長、代謝、凋亡，在神經保護中具有重要作用。HDAC5通過使mTOR相關調節蛋白Raptor脫乙酰化激活mTOR途徑，促進視神經再生〔34〕。神經元膜糖蛋白(GP)M6A是HDAC5調控的轉錄因子MEF2C的直接靶基因，在神經發育過程起重要作用。微小RNA(miR)-124和miR-9通過靶向其3'-非翻譯區(UTR)直接抑制HDAC5的表達，激活MEF2C-GPM6A途徑促進神經元軸突和樹突發育〔35〕。PD早期發展與α-突觸核蛋白(Syn)誘導的多巴胺能神經元變性密切相關，HDAC5在成年小鼠黑質致密區多巴胺能神經元中表達，研究顯示，使用siRNA敲減HDAC5的可促進SH-SY5Y細胞中的神經元軸突生長，HDAC5抑制劑MC1568能夠上調神經營養因子骨形成蛋白(BMP)2的表達，并促進培養的大鼠多巴胺能神經元軸突和樹突生長〔36〕。綜上所述，HDAC5在神經元中的高表達及核聚集都具有神經毒性作用，而核移出及HDAC5抑制劑可能成為治療PD等神經退行性疾病的藥物研究的靶標。

3.2.3其他Ⅱa HDACs 研究發現HDAC7的去乙酰化作用促進神經膠質瘤發展。鋅指蛋白(ZNF)326可以通過其轉錄激活結構域和鋅指結構與HDAC7特定啟動子區域結合而激活HDAC7轉錄，上調的HDAC7與β-連環蛋白(catenin)的相互作用導致賴氨酸(Lys)-49的β-catenin乙酰化水平降低，由于改變空間位阻并抑制相鄰的Ser-45的β-catenin磷酸化水平，未磷酸化的β-catenin則可以進入細胞核并激活Wnt信號通路促進神經膠質瘤發生和發展〔37〕。

研究發現HDAC9參與調節軸突分支。在體外培養的丘腦和皮層細胞中，熒光蛋白標記的HDAC9在培養過程中在核質中穿梭。轉染基因突變的HDAC9則減少體外培養丘腦皮質(TC)的軸突分支。但破壞HDAC9和MEF2之間的相互作用，可逆轉軸突分支，表明HDAC9的核質易位通過影響轉錄調節和下游信號轉導途徑在TC軸突分支過程中起關鍵作用〔38〕。

3.3Ⅱb類HDACs HDAC Ⅱb具有2個脫乙酰基酶結構域，參與微管和肌動蛋白依賴性細胞運動調控。HDAC6被認為是哺乳動物細胞中最主要細胞質脫乙酰酶，除組蛋白，HDAC6還可使中樞神經元相關蛋白去乙酰化，在突觸形成和遞質運輸過程中起關鍵作用，而關于HDAC10的了解較少。

HDAC6具有同其他的HDACs不同的特點，即特異性定位于細胞質并具有兩個催化結構域。因HDAC6的無序N末端是微管結合域，因此，HDAC6最先被認為是α-微管蛋白(tubulin)脫乙酰基酶〔39〕。后來發現HDAC6也可使其他蛋白脫乙酰化，如tau蛋白、熱休克蛋白(HSP)90、皮層肌動蛋白結合蛋白(cortactin)等〔40〕。HDAC6發揮作用與其對不同的目標蛋白乙酰化作用有關，而不是對組蛋白乙酰化作用和隨后對染色質產生作用的結果。

已知tau蛋白磷酸化和Aβ沉淀聚集是AD的重要病理學特征。Tau蛋白過度磷酸化會促進tau蛋白聚集，從而降低其結合和穩定微管的能力。研究表明，HDAC6能夠與人腦組織中的tau蛋白相互作用，抑制HDAC6作用可減弱tau蛋白T231位點的磷酸化〔41〕。此外，使用HDAC6的新型抑制劑MPT0G211能夠使AD模型中tau 蛋白的磷酸化水平降低，并改善認知功能障礙〔42〕。最新研究發現，異常的tau蛋白乙酰化導致有毒tau蛋白低聚物的形成促進突觸變性和認知功能障礙，HDAC6不僅能使tau蛋白脫乙酰化，而且還可抑制微管結合區內tau蛋白的過度磷酸化，這可能與腦的病理狀態有關，如在tau蛋白病變低于特定閾值的條件下，HDAC6的丟失或抑制可能具有神經保護作用〔43〕。Aβ 影響微管及其信號通路，進而影響細胞內囊泡運輸，最終使線粒體和神經遞質的傳遞速率減慢、突觸降解。抑制 HDAC6使過氧化物還原酶(Prx)1乙酰化增強，可挽救 Aβ 引起的線粒體軸突運輸的損害〔44〕。因此，抑制 HDAC6 可使 tau 蛋白降解，緩解Aβ產生的損傷，因此，HDAC6特異性抑制劑可能是治療AD的有效的藥物。

微管是細胞骨架的主要成分，對于維持細胞形狀、軸突再生、物質轉運、細胞運動、DNA 分離等都起到不可或缺的作用。在微管形成過程中，α-tubulin翻譯后修飾，如乙酰化對于微管及細胞功能的維持都至關重要。HDAC6過表達則可使 tubulin 脫乙酰化，從而降低微管穩定性〔45〕。硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)和髓磷脂相關糖蛋白(MAG)是中樞神經系統軸突生長的抑制劑，CSPG和 MAG 能夠下調α-tubulin乙酰轉移酶(TAT)1，與HDAC6協同導致α-tubulin乙酰化減少，而抑制HDAC6可以逆轉CSPG和MAG對軸突生長的抑制作用〔46〕。研究表明，在PD和ALS等中樞神經退行性疾病中，抑制HDAC6所發揮的神經保護作用都可能與增加 tubulin 乙酰化、改善軸突運輸有關〔47，48〕。HDAC6除作用于tubulin還作用于軸突中其他底物，如HDAC6可使線粒體外膜蛋白Miro1 脫乙酰化，降低了軸突中線粒體的運輸，而線粒體通過提供三磷酸腺苷(ATP)并充當Ca2+的儲存位點，在生長和成熟的軸突中發揮多種作用〔49〕。研究結果表明Miro1的突變會破壞Ca2+穩態，使ATP產生減少和鈣依賴性線粒體凋亡和自噬，這可能是PD的發病機制之一〔50〕。

3.4Ⅳ類HDACs Ⅳ只包含一個成員HDAC11，由于其發現較晚，所以對其在中樞神經系統發揮的作用了解較少。有研究發現，HDAC11通過直接結合轉錄因子PU.1影響趨化因子配體(CCL)2啟動子上的PU.1-DNA相互作用來促進CCL2的表達進而促進神經炎癥〔51〕。

綜上，乙酰化-去乙酰化平衡對于維持正常的基因表達和蛋白質功能至關重要。HDACs作為調控組蛋白乙酰化水平的關鍵因子，其表達異常則影響基因表達，從而參與多種中樞神經系統疾病的發生發展過程。同時，HDACs還可使非組蛋白蛋白質去乙酰化調控蛋白質功能，故未來研究可將HDACs的異常表達同疾病相關基因和蛋白聯系起來探索疾病發生病理生理學基礎，并且，合成更多特異性靶向HDACi無論是作為工具藥研究HDACs的作用，還是今后作為治療藥物都具有廣闊前景。