CircRNA影響NSCLC增殖、侵襲相關信號通路研究進展

高圣鈺 劉爽 魏微微 李萌 陳思宇 孟凡石

(佳木斯大學 1附屬第一醫院普外一科，黑龍江 佳木斯 154002；2基礎醫學院)

肺癌(LC)患病率和病死率在全球范圍內呈逐年遞增趨勢。2018年全球癌癥協會統計全球新增病例約有209萬和死亡病例約有176萬〔1〕。LC現在已經成為全球最常見的惡性腫瘤和致死原因之一〔2〕。依據組織病理學可以將LC分為占80%～85%非小細胞肺癌(NSCLC)及占15%～20%小細胞肺癌(SCLC)〔3〕。雖然近代醫學在診斷技術及治療手段 (包括手術、放療和化療)方面不斷進步，但大部分LC患者就診時已進入晚期〔4〕。Sun等〔4〕報道早期LC可以治愈，所以確定LC生物標志物或治療靶點對降低死亡率和改善臨床預后具有重大意義。隨著高通量測序技術和生物信息學分析技術的發展，許多研究表明環狀RNA(CircRNA)在癌癥中影響細胞侵襲、遷移和增殖。Yao等〔5〕通過分析來自寧波第二醫院的94例肺腺癌(LUAD)組織和臨近正常組織發現，circ-0006427在LUAD中表達活躍，調高Dicckkopf相關蛋白(DKK)1的表達量，可以使Wnt/β-catenin信號通路失活，抑制LUAD的增殖、遷移和侵襲。CircRNAs是蛋白質編碼基因的完整外顯子產生的，其通過反向剪接的過程生成。由于缺少游離的3′或5′末端，CircRNAs的半衰期較長，這使其對線性RNA衰變的常規機制具有抵抗力。此外有研究表明CricRNAs可以通過信號通路影響癌組織的轉移、增殖及侵襲，可以為LC的治療提供新的靶點。然而CircRNAs通過影響信號通路調節LC的分子機制尚未完全明確。本文就CircRNAs通過信號通路影響NSCLC發生發展的進展進行總結。

1 CircRNA的生物學功能

CircRNAs是一種特殊的非編碼RNA分子，CircRNAs的結構是共價封閉的環，在3′端沒有聚腺苷酸尾，在5′端沒有帽狀結構，其大小為100 bp至4 kb〔6～9〕。CircRNA的特殊結構使它更耐核糖核酸酶(RNase)或RNA外核酶降解。CircRNAs的功能是可以作為miRNA的海綿參與細胞的生物學過程，還可以調節親本基因的轉錄，同時能作為蛋白質之間的銜接子發揮作用及具有蛋白質翻譯功能〔2，7，10，11〕。Militello等〔12〕研究表明CircRNAs可能是腫瘤中的特殊分子標記物。

2 CircRNAs調控信號通路參與NSCLC的發生發展

2.1CircRNA與Wnt信號通路 Wnt/β-catenin是經典的信號通路〔13〕。Peng等〔14〕報道circRNAs通過影響Wnt通路的激活與失活調節癌癥的發生進展。Wan等〔15〕對隸屬于華中科技大學同濟醫學院的同濟醫院病理科，經病理確診的78例NSCLC患者癌與癌旁組織及NSCLC細胞系A549、NCI-H460進行熒光定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)定量檢測，結果顯示circ-E3泛素化蛋白鏈接酶(ITCH)在NSCLC組織和NSCLC細胞系(A549、NCI-H460)中表達量降低。通過調高體外NSCLC細胞系A549和NCI-H460中circ-ITCH表達量，circ-ITCH可以競爭性的抑制miR-7和miR-214與ITCH相結合，促進ITCH表達水平增高。而ITCH是E3泛素連接酶的成員，該酶可以調節蛋白質的穩定性、免疫反應及癌癥的進展。所以當ITCH表達活躍后可以促進磷酸化蓬亂蛋白(Dvl)2的降解使Wnt/β-catenin信號失活〔16〕，導致通路下游調節細胞黏附的β-catenin、參與細胞增殖、細胞生長的原癌基因(c-Myc)及參與調控細胞周期的細胞周期素D1表達失活，從而抑制NSCLC細胞增殖。Yao等〔17〕通過對寧波市第二醫院收集的72對原發性LVAD患者的癌與癌旁組織進行微陣列分析，發現circ-0001946表達量升高。同時應用RT-qPCR對LUAD細胞系(H1299、A549、Calu3、 SPC-A1)中circ-0001946的含量進行測定，結果表明circ-0001946在四組細胞系中表達活躍。應用細胞轉染技術降低A549和H1299細胞系中circ-0001946表達量可以明顯抑制LAC體外細胞的增殖，促進細胞凋亡。而后通過生物信息學技術預測miR-135a-5p的下游靶基因為沉默調節蛋白(SIRT)1，而SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰基酶，可以調節Wnt信號通路的激活〔18〕。所以當circ-0001946與miR-135a-5p結合，SIRT1表達活躍使Wnt/β-catenin通路激活，導致通路下游調節細胞黏附的β-catenin、參與細胞增殖和細胞生長的原癌基因(c-Myc)及調節細胞周期的細胞周期素D1表達活躍，從而促進LUAD的增殖。Gao等〔19〕應用微陣列分析技術和RT-qPCR技術分別檢測從吉林大學中日聯合醫院收集的LUAD癌組織及其臨近的正常組織及LUAD細胞系(A549、SPC-A1、H1299、PC-9)中circ-SOX4的表達量，結果表明circ-SOX4在LUAD組織和細胞系中表達活躍。當circ-SOX4表達下調后，miR-1270與多形性腺瘤基因樣(PLAGL)2相結合，導致PLAGL2表達量降低，而PLAGL2是一個假定C2h2鋅指轉錄因子，其異常激活可以調節Wnt/β-catenin信號通路激活導致細胞增殖失調，促進癌癥的發生〔20〕，所以PLAGL2表達失調后抑制Wnt通路激活，抑制其下游調節細胞生長和黏附的連環蛋白β1、參與調節細胞周期的細胞周期蛋白(CCND)1、同樣起調節細胞周期作用的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)2及調節細胞增殖的原癌基因c-Myc和影響癌細胞侵襲性的基質金屬蛋白酶(MMP)2的表達，從而抑制LUAD中細胞增殖、侵襲、遷移和腫瘤生長。此外在A549和H299細胞株中上調circ-SOX4的表達量，可以抑制miR-1270活性，增加PLAGL2表達量，同時提高CD44和N-鈣黏蛋白的蛋白質水平，降低E-鈣黏蛋白的水平，繼而促進癌細胞侵襲和轉移。

2.2CircRNA與PI3K信號通路 PI3K/PKB又稱磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，其可以調節細胞增殖和凋亡，PI3K/PKB通路的異常激活可能與惡性腫瘤密切相關〔21〕。Wu等〔21〕通過研究檢測60例NSCLC癌與癌旁組織中circ-環乙酰輔酶A羧化酶α(ACACA)的表達量，結果顯示其表達量上調。通過抑制體外細胞系A549和H1299中circ-ACACA的表達。circ-ACACA活性降低誘導磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)激活，而PTEN作用機制是通過抑制PI3K途徑下調信號傳導的能力，繼而抑制腫瘤細胞的發展〔22〕。所以PTEN表達活躍抑制PI3K/PKB信號通路下游靶基因p-PI3K/t-PI3K和p-PKB/t-PKB表達，從而抑制NSCLC的增殖和遷移。此外，circ-ACACA與miR-1183有結合位點，調高體外A549和H1299細胞系中circ-ACACA的表達量，導致miR-1184的活性降低，導致NSCLC細胞系中與細胞分化有關的c-Myc、與細胞遷移有關的明膠酶MMP9和與糖醇解有關的葡萄糖轉運蛋白(GLUT)-1的蛋白水平升高，結果顯示circ-ACACA的表達上調顯著激活c-Myc、MMP9、GLUT-1蛋白活性，從而促進NSCLC細胞增殖和遷移并增強了瓦伯格效應。Bai等〔23〕對收集于煙臺市玉皇頂醫院的51例經病理確診的NSCLC組織和鄰近正常組織及購買于首爾國立大學醫學院的A549、H1299細胞株進行RT-qPCR測量，結果顯示circ蛋白激酶Cα(PRKCA)在NSCLC組織和A549、H1299細胞系中表達活躍。通過沉默NSCLC細胞系中circPRKCA表達，導致miR-330-5p活躍。而miR-330-5p可以與3-磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)-1 3′非翻譯編碼區(UTR)結合，削弱PDK1的表達。而PDK1屬于AGC激酶家族，代表PI3K途徑的關鍵節點〔24〕。所以PDK1活躍度降低抑制PI3K/PKB信號通路激活，導致其下游PKB磷酸化水平降低，從而抑制NSCLC細胞外活力、遷移、侵襲。

2.3CircRNA與核轉錄因子(NF)-κB信號通路 NF-κB信號通路在癌癥的進展中起重要作用，NF-κB可以參與調節癌癥基因的表達，影響癌細胞的增殖、遷移和凋亡〔25〕。Zhou等〔26〕對收集于中國科學院大學腫瘤醫院的32例LUAD組織和鄰近正常組織進行檢測，結果表明circ_cMras在LUAD組織中表達降低。熒光定量PCR技術測得LUAD細胞系A549、HCC827中circ_cMras水平降低。表明通過使A549、HCC827細胞系中circ_cMras異常表達，可以降低LUAD細胞的增殖、遷移、侵襲，加快細胞凋亡。其機制是通過轉染調高細胞系A549、HCC827中circ_cMras表達量，使ABHD5活躍，而ABHD5是含α-β水解酶結構域5，是脂肪甘油三酸酯脂肪酶(ATGL)介導的脂解的高度保守的調節劑〔27〕。ABHD5可以通過脂多糖依賴性激活相關通路抑制癌細胞的合成代謝〔10〕。所以當ABHD5表達上調，ABHD5作為ATGL的共激活因子協同上調，從而抑制NF-κB通路激活，使其下游p-P65磷酸化活性下降，抑制LUAD細胞的遷移、增殖，加速細胞凋亡。

2.4CircRNA與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路 CircRNA通過調節MAPK信號通路激活或失活，影響細胞分化、凋亡、血管生成、增殖和腫瘤擴散〔28〕。circ-ZKSCAN1(hsa_circ_0001727) 是 一 種 來 源 于 ZKSCAN1基因第二和第三外顯子(全長668 bp)的RNA〔29〕。Wang等〔29〕通過對收集于青島大學附屬醫院胸外科的107例NSCLC癌與癌旁組織進行RT-qPCR檢測，結果表明circ-ZKSCAN1在NSCLC組織中表達量增高。同時在NSCLC細胞系(A549、H1299)中circ-ZKSCAN1也同樣檢測到其水平升高。表明在細胞系A549、H1299中敲除Circ-ZKSCAN1，可以減慢細胞增殖、遷移，同時加快細胞的凋亡。此外，circ-ZKSCAN1高表達可以與miR-330-5p結合，抑制miR-330-5p與FAM83A的3′UTR區域結合。而FAM83A是具有序列相似性家族成員A，其位于8號染色體上參與細胞增殖、分化和凋亡〔28，29〕。FAM83A可以通過抑制MAPK通路發揮作用，所以當FAM83A表達活躍，導致MAPK通路失活。其下游參與細胞凋亡的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和同樣參與細胞凋亡的促分裂原激活的蛋白激酶(p38)，參與調節細胞增殖、分化的細胞外信號調節激酶(ERK)表達量降低，從而促進NSCLC增殖分化、遷移及減緩細胞凋亡。

2.5CircRNA與Janus激酶(JAK)2/信號轉導和轉錄激活(STAT)3信號通路 JAK2/STAT3信號通路的失調與許多癌癥的進展和轉移有關〔30，31〕。Li等〔31〕研究發現Circ_ZNF124在肺癌細胞系(A549、H1975、H1299、HCC827)中高表達。隨機選取A549、H975細胞系通過轉染敲低circ_ZNF124表達水平，發現其可以誘導A549、H1975細胞周期停滯，降低其細胞增殖和轉移的能力。降低circ_ZNF124在細胞系A549和H1975中的表達量，導致miR-337-3p水平活躍，作為miR-337-3p下游靶基因的JAK2和STAT3活性被抑制，使JAK2/STAT3信號通路失活，其參與細胞凋亡的B細胞淋巴瘤(BCL)2、參與細胞分化、增殖、存活、缺氧的原癌基因(c-FOS)和參與糖醇解的異二聚體轉錄因子低氧誘導因子(HIF)1的亞基(HIF1a)的靶基因活性受到抑制，導致NSCLC細胞遷移、增殖被抑制，同時促進細胞凋亡。

綜上，CircRNAs可以通過Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB、MAPK、JAK2/STAT3信號通路影響LC的遷移、增殖、侵襲，調節細胞凋亡。同時發現在甲狀腺癌35、乳腺癌36等惡性腫瘤中CircRNAs也可以通過信號通路調控細胞的增殖、遷移、侵襲。遺憾的是CircRNA目前種類眾多，還存在有尚未完善的信號通路，如AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)、Notch、骨形態發生蛋白(BMP)等信號通路。研究CircRNA通過信號通路影響LC增殖、侵襲的分子機制可能為LC的治療提供新的思路。