基于Th細胞失衡探討酸棗仁湯對失眠小鼠認知能力的影響

呂晴 劉香杰 李俊瑩 蔣國舉 谷雨霏 楊曉彤 戴馨樂 翟靖 王怡欣 劉東云 馮卓航 鄭璐璐 趙祎 杜盼盼 張?zhí)m寧 張玉嬌 李曉冰

(河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450008)

失眠又稱入睡和維持睡眠障礙，是指無法入睡或無法保持睡眠狀態(tài)，導致睡眠不足，表現(xiàn)為各種原因引起入睡困難、睡眠深度或頻度過短、早醒及睡眠時間不足或睡眠質(zhì)量差等，是一種常見病。隨著失眠程度的加重，失眠患者注意力、記憶力、學習能力等認知功能下降〔1〕。目前常用于治療失眠的藥物有地西泮、阿普唑侖、三唑侖、佐匹克隆、水合氯醛等，這些西藥都有一定的不良反應(yīng)，包括頭暈、嗜睡、乏力等“宿醉”現(xiàn)象，且部分藥物會導致口苦、口干、惡心、嘔吐、肌無力等癥狀。另外，長期用藥易產(chǎn)生耐受性、成癮性和戒斷癥狀。相較于現(xiàn)代醫(yī)學，中醫(yī)學對本病的治療有著獨特優(yōu)勢。酸棗仁湯為治療失眠的經(jīng)典名方，副作用小，對失眠療效確切〔2〕。既往對酸棗仁湯治療失眠研究多從神經(jīng)遞質(zhì)角度論證。炎癥狀態(tài)在失眠發(fā)生中起重要作用，但是目前相關(guān)研究較少。本研究探討酸棗仁湯對失眠模型小鼠白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-10水平的影響。

1 材料與儀器

1.1動物 SPF級昆明小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由鄭州大學動物實驗中心提供〔產(chǎn)品許可證：SCXK(豫)2019-0002〕。

1.2實驗藥品及制備 酸棗仁湯：炒酸棗仁，甘草，川芎，知母、茯苓中藥飲片，購于河南張仲景大藥房；對氯苯丙氨酸(PCPA)：美國Sigma公司，批號：1002094970；小鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-10測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3實驗儀器 全自動酶標儀(美國Bio-tek公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(廣州市康恒儀器有限公司)，高速離心機(貝克曼庫爾特公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1分組與給藥 昆明種小鼠40只，隨機分為5組，分別為正常組、模型組、地西泮組、酸棗仁湯低(SZR-L)、高劑量(SZR-H)組，每組8只。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，實驗第4天地西泮組(0.92 mg/kg)及中藥高(4.8 g/kg)、低劑量(2.4 g/kg)組分別灌胃治療，1次/d，正常組及模型組給予相同劑量生理鹽水灌胃，給藥10 d。

1.4.2模型制備 除正常組外，其余各組小鼠每日腹腔注射PCPA混懸液300 mg/kg，連續(xù)3 d。觀察小鼠的行為學變化，選取晝夜節(jié)律消失，對外界的聲、光等刺激敏感，攻擊性增加，警惕性高，整體觀察與正常組有明顯不同的小鼠作為失眠鼠納入實驗。

1.5觀察指標

1.5.1曠場實驗 曠場箱(50 cm×50 cm×40 cm，周壁顏色為黑色，底面平均分為25個10 cm×10 cm小方格)正上方架攝像頭，視野覆蓋整個曠場。將小鼠放置在正中央格(實驗前，小鼠適應(yīng)1 min)，同時進行攝像和計時，時間為3 min。觀察并記錄小鼠總運動距離、總站立次數(shù)、中心區(qū)域運動時間。

1.5.2Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮水池直徑120 cm，高度為50 cm；平臺直徑6 cm，高度為30 cm，表面粗糙。水池劃分為東西南北4個象限(東北NE，東南SE，西南SW，西北NW)，象限池壁圓弧中點為可選的動物入水點，平臺可放在任意一個象限內(nèi)。進行水迷宮訓練，實驗前將小鼠置于站臺上，適應(yīng)10 s，隨后將小鼠NE、NW象限分別面壁置入池內(nèi)，小鼠登上站臺5 s后終止記錄，若小鼠在60 s內(nèi)不能上臺，引導其登上站臺適應(yīng)10 s，最后將小鼠擦干，放入鼠籠，如此將小鼠置入游泳池，每天2次，每次間隔1 h，定位航行訓練需要3 d，定位航行訓練后進行空間探查實驗，記錄小鼠平臺探索總時間、平臺探索總距離、目標象限探索時間、穿越平臺次數(shù)(60 s)，以評判小鼠的空間記憶能力。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平 采用ELISA檢測血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1酸棗仁湯對失眠小鼠曠場實驗影響 與正常組相比，模型組總運動距離、總站立次數(shù)明顯增加，中心區(qū)域運動時間明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H、地西泮組總運動距離、總站立次數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)；中心區(qū)域運動時間延長(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.2酸棗仁湯對失眠小鼠水迷宮實驗影響 與正常組相比，模型組平臺探索總時間、總距離明顯增加(P<0.01)；目標象限(四象限)探索時間百分比，穿越平臺次數(shù)明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H組平臺探索總時間顯著降低(P<0.05)；目標象限探索時間百分比及穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.01，P<0.05)。地西泮組平臺探索總時間、平臺探索總距離顯著低于模型組(P<0.01)，穿越平臺次數(shù)顯著增多(P<0.01)。見表2。

2.3酸棗仁湯對失眠小鼠血清炎性因子影響 與正常組相比，模型組血清IL-1、IL-2水平明顯升高，IL-4、IL-10水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H、地西泮組IL-1、IL-2水平降低，IL-4及IL-10水平升高，除SZR-L組IL-4和地西泮IL-10外，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 酸棗仁湯對失眠模型小鼠曠場實驗影響

表2 酸棗仁湯對失眠模型小鼠水迷宮實驗及血清炎性因子影響

3 討 論

目前常用的小鼠失眠造模方法有：強迫運動法造模、人為物理因素刺激法造模、腹腔注射PCPA造模等。PCPA造模法是現(xiàn)階段公認的失眠模型。PCPA通過選擇作用有效抑制色氨酸羥化酶活性，導致5-羥色胺(HT)的合成減少，睡眠晝夜節(jié)律消失，幾乎達到完全失眠，且不會對神經(jīng)元造成實質(zhì)性損害，待注射劑量全部代謝后，可逐步恢復正常〔3〕。故本實驗選取腹腔注射PCPA法造模。

曠場實驗是常用的動物行為學評價實驗，可檢測小鼠自發(fā)活動行為和探索行為，是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度實驗方法。曠場實驗中，運動距離反映小鼠的活動度和興奮性，站立次數(shù)、中心區(qū)域運動時間反映小鼠對陌生環(huán)境的好奇程度和探索趨勢〔4〕。Morris水迷宮是20世紀80年代由英國生理學家Morris設(shè)計并應(yīng)用于評估嚙齒類動物學習記憶功能的重要工具，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于認知功能研究〔5〕。本研究結(jié)果提示酸棗仁湯可有效延緩失眠小鼠認知功能障礙進程，改善其學習能力及記憶能力。

研究發(fā)現(xiàn)長期慢性炎癥與認知功能減退關(guān)系密切〔6〕。另有研究表明，失眠患者Th1/Th2亞群平衡失衡〔7〕。既往研究表明，免疫系統(tǒng)與睡眠存在雙向聯(lián)系，而炎性因子是這種雙向作用中至關(guān)重要的介質(zhì)〔8〕。Th1細胞對初始CD4+T細胞具有一定刺激作用，產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、IL-2等炎性因子〔9〕。睡眠不足可激活小膠質(zhì)細胞使IL-1β(促炎因子)表達增加，直接引起炎癥反應(yīng)，導致細胞凋亡與免疫損傷〔10〕。IL-2具有加快炎癥細胞增殖的作用，可導致更多炎性介質(zhì)的釋放，破壞體內(nèi)細胞因子穩(wěn)態(tài)，干擾睡眠節(jié)律，從而導致失眠。睡眠質(zhì)量越差，促炎介質(zhì)分泌越多〔11〕。Th2細胞通過轉(zhuǎn)錄激活因子6及信號轉(zhuǎn)導，分泌IL-4、IL-6、IL-10等炎性因子〔9〕。IL-4具有抗炎效應(yīng)，可與具有促炎效應(yīng)的細胞因子發(fā)生拮抗作用。IL-10具有很強的抗炎及免疫抑制活性，能減少炎性介質(zhì)及其受體表達，抑制炎性細胞的增殖和遷移，對急慢性炎癥均有一定抑制作用〔12〕。本實驗結(jié)果提示酸棗仁湯可能通過調(diào)控Th1/Th2細胞平衡改善失眠小鼠認知功能。