基于RhoA/ROCK信號通路研究上調miR-19b對MSCs成骨分化的影響

陳順玲 許和貴 朱旭 楊砥

(貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴州 貴陽 550002)

骨質疏松是一種代謝性骨骼疾病，骨量減少、成骨細胞和破骨細胞失衡、骨組織結構破壞是該病的主要特征〔1〕，隨著年齡的增長，女性逐漸進入絕經(jīng)期，其體內性激素水平會急劇減少，鈣調節(jié)激素分泌紊亂，微量元素不足，最后導致骨質疏松發(fā)生〔2〕。骨髓間充質干細胞(MSCs)具有較強的自我更新能力和定向分化作用，可在體外培養(yǎng)，在一定的條件下可分化為成骨細胞和軟骨細胞，同時還具有免疫調節(jié)作用〔3〕，MSCs也是導致成骨細胞分化失衡的主要原因，MSCs成骨分化過程中細胞骨架會發(fā)生一系列變化，而Ras同源基因家族成員(Rho)A/Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信號通路參與細胞骨架的調控過程〔4〕。本研究基于RhoA/ROCK信號通路研究上調miR-19b對MSCs成骨分化的影響。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取清潔及健康雌性昆明大鼠36只，2～3月齡，平均(2.38±0.47)個月，體重250～300 g，平均(261.25±23.75)g，均為解放軍總醫(yī)院實驗動物研究中心提供，許可批號：SCXK(粵)2020-0055。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度27℃，濕度60%，飲水和飲食自由。

1.2骨質疏松大鼠模型建立 從清潔及健康的24只雌性大鼠中，隨機選取6只分為正常組，剩余18只建立骨質疏松模型，參考文獻〔5〕建立骨質疏松大鼠模型，先沿大鼠背部脊柱兩側剃毛，注射2% 40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹部正中間行縱向切口，尋找左邊和右邊末端的卵巢，行結扎切除手術，注射青霉素預防感染。

1.3MSCs培養(yǎng) 頸椎處死骨質疏松模型大鼠和正常組大鼠，將其置于75%乙醇中浸泡10 min，無菌環(huán)境下暴露大鼠后肢，然后切開其皮膚，沿著膝關節(jié)處剪開，取出多余的組織和韌帶，再沿著大鼠髖關節(jié)和踝關節(jié)處剪切，隨后取出大鼠脛骨和股骨，將脛骨和股骨浸泡在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，清洗3次，直至脛骨和股骨周圍的組織全部去除，然后吸取培養(yǎng)基中5 ml的溶液，離心15 min，制作單細胞懸液，與4%乙酸混合，顯微鏡下計數(shù)，將細胞接種在50 cm2的培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)。

1.4堿性磷酸酶、茜素紅染色 將5 mmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、10%胎牛血清(FBS)用改良愛德華培養(yǎng)基(MEM)在無菌條件下稀釋至10 ml，混合4℃保存。細胞生長到融合狀態(tài)進行消化傳代，將第三代細胞在6孔板中接種，當細胞鋪滿瓶底80%將培養(yǎng)液吸出，7 d后進行堿性磷酸酶染色在室溫環(huán)境下進行，需要避光染色15 min，14 d后進行茜素紅染色，在37℃環(huán)境中孵育30 min。

1.5分組 將18只骨質疏松模型大鼠分為模型組、空白組和上調組各6只，模型組和空白組給予等體積的生理鹽水進行干預，空白組將5 μl的慢病毒注射到大鼠體內，為無意義序列，上調組在大鼠體內注射5 μl的miR-19b慢病毒，慢病毒引物序列為：上游：5′-ACTGAGCGATGAGCAGGC-3′，下游5′-CTTCGGGCCAGTAACGTTAGGG-3′，連續(xù)干預2 w。

1.6檢測miR-19b表達量 聚合酶鏈反應檢測miR-19b表達量，取MSCs細胞以1×105個/ml的密度接種于6孔板，每孔2 ml，72 h后Trizol法提取總RNA，并逆轉錄cDNA，用95℃無RNA酶水洗脫出miR-19b，PCR循環(huán)參數(shù)設定為95℃ 10 min，然后90℃ 15 min，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后使用2-ΔΔCt法檢測miR-19b表達量。

1.7成骨細胞、信號通路相關蛋白檢測 采用Western印跡檢測特異性轉錄因子(OSX)、骨黏連蛋白(OSN)、骨橋蛋白(OPN)、RhoA、ROCK蛋白表達量，實驗步驟：將MSCs細胞接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進行處理，將采集到的樣本研磨加入蛋白緩沖液，提取各組細胞蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入發(fā)光液曝光3～4次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白為GAPDH。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行齊性方差檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1成骨細胞形態(tài)學觀察 如圖1所示，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離出來的原代成骨細胞貼壁生長，多為邊形或者梭形，僅有一小部分細胞的表面可見細小的突起，與鄰近的細胞相連接；培養(yǎng)出來的第三代細胞系生長較快，大多數(shù)細胞呈棱形或者錐形。

圖1 成骨細胞形態(tài)學觀察(×200)

2.2miR-19b在各組中的表達水平 如表1所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調組miR-19b表達量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調組miR-19b表達量明顯升高(P<0.05)；與空白組相比，上調組miR-19b表達量明顯升高(P<0.05)。

2.3miR-19b對成骨細胞相關蛋白的影響 如表1所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調組OSX、OSN、OPN水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調組OSX、OSN、OPN水平明顯升高(P<0.05)；與空白組相比，上調組OSX、OSN、OPN水平明顯升高(P<0.05)。

2.4成骨細胞分化能力觀察 如圖2所示，成骨誘導液誘導7 d后進行堿性磷酸酶染色，14 d后進行茜素紅染色結果顯示：成骨細胞礦化誘導后產生大量的礦化結節(jié)，堿性磷酸酶染色顯示成骨細胞分化能力增強。

表1 miR-19b在各組中的表達水平及其對成骨細胞相關蛋白和Rho/ROCK信號通路的影響

2.5miR-19b對成骨細胞RhoA/ROCK信號通路的影響 如表1、圖3所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調組RhoA、ROCK水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調組RhoA、ROCK水平明顯降低(P<0.05)；與空白組相比，上調組RhoA、ROCK水平明顯降低(P<0.05)。

圖2 成骨細胞分化(×200)

圖3 Western印跡檢測各組RhoA、ROCK蛋白表達

3 討 論

骨質疏松是由于骨代謝中的骨吸收和骨生成失衡所導致的一種疾病，可導致患者骨量減少、骨密度降低，進而引起一系列的臨床癥狀，該病是一種增齡性病變，隨著我國人口老齡化的加速，骨質疏松的發(fā)病率逐年上升〔6，7〕。有研究指出〔8〕，隨著骨質疏松患者骨量的減少，骨微結構的改變，會導致患者出現(xiàn)腰酸背痛、四肢疼痛、脊柱畸形、骨折的問題，其中骨折是導致患者發(fā)生全身性骨病的主要原因，嚴重影響患者的生活質量。成熟的成骨細胞存在于骨膜內層和骨膜小梁表面，成骨細胞和成骨細胞的定向分化促進成骨細胞的形成，正常的骨量可維持成骨細胞骨的形成和破骨細胞的骨吸收〔9〕，在成骨過程中，基質分泌的膠原蛋白可為礦物質沉積提供纖維框架，使類骨質礦化成正常骨組織。MSCs是成骨細胞的原始細胞，在骨質疏松癥患者骨代謝失衡過程中起骨修復作用，近年來發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，MSCs也會逐漸呈老化狀態(tài)，再加上骨代謝的嚴重失衡，會進一步形成骨質疏松〔10〕。MSCs化為成骨細胞是一個極為復雜的過程，該過程必須在多種信號通路的作用下才能進行，且骨鈣素和堿性磷酸酶是MSCs成骨分化的重要表現(xiàn)〔11，12〕。研究指出〔13〕，MSCs具有一定的多向分化的能力，在相關條件的誘導下，其可定向分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞。

miRNA轉錄后可通過抑制靶基因的表達控制疾病的進一步發(fā)展，其差異表達可能在骨質疏松中發(fā)揮重要作用〔14，15〕。已有研究證實〔16〕，miRNA與骨的胚胎發(fā)育，調節(jié)干細胞成骨作用和軟骨細胞代謝中具有重要作用。miR-19b是否直接參與了成骨的調控，目前尚不明確，但當miR-19b表達量上升時可有效抑制膠原蛋白的合成，促進骨質礦化，有利于骨質生成。本文研究中，上調miR-19b表達量可促進MSCs成骨分化〔17，18〕。有研究指出〔19〕，miR-19b在骨質疏松患者體內其表達量顯著下降，且在骨質疏松伴隨骨折患者的外周血中下降的尤為明顯，提示miR-19b與骨量丟失呈負相關，miR-19b表達量越高，成骨細胞分化能力越強，為臨床上治療骨質疏松提供新的方向。OSX能反映成骨細胞分化程度，其只在骨組織細胞中表達，與骨質疏松的發(fā)生與發(fā)展密切相關。研究指出〔20〕，OSN可與Ⅰ型膠原相結合形成非可溶性復合物，進而促進鈣、磷持續(xù)性沉淀，最后形成羥基磷灰石結晶，羥基磷灰石結晶上的陰離子末端可通過與骨黏連蛋白相結合，然后形成羥基磷灰石-OSN-Ⅰ型膠原復合物，這一過程可有效促進骨的生成和骨的重建，促進骨質疏松患者身體的恢復。OPN是一種重要的細胞黏附因子和趨化因子，能促進骨基質的礦化，維持骨的完整性，參與骨重塑過程，具有細胞黏附蛋白和細胞因子的雙重作用，可參與成骨細胞表面各種酶的活化，在MSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用。本研究提示，上調miR-19b可提高OSX、OSN、OPN蛋白水平，改善骨質疏松大鼠MSCs成骨分化。

RhoA/ROCK信號通路在調控成骨細胞活性中起著重要作用，RhoA是Ras超家族成員之一，其可以通過下游的效應因子促進細胞肌動蛋白骨架的重建，ROCK是目前研究較為深入的一種Rho下游底物〔21〕，而Rho在成骨細胞分化，各種生理、病理過程中均發(fā)揮重要作用，其可將細胞外的基質信號，傳遞到細胞骨架之中，繼而改變成骨細胞的形態(tài)。研究指出〔22〕，RhoA/ROCK信號通路在參與細胞骨架形成的過程中，可通過改變細胞之間不同的接觸面積來促進成骨分化。本研究提示，上調miR-19b可通過調控RhoA/ROCK通路蛋白來改善骨質疏松大鼠MSCs成骨分化。