降壓寶藍片對SHR腎損害及激肽釋放酶-激肽系統的影響

周紅艷 張薇 楊丹 王曉麗 時麗菲 孫江偉 王軍

(1河南省中醫藥研究院中藥藥理實驗室，河南 鄭州 450004； 2河南省省立醫院藥學部)

高血壓已成為心血管疾病中發病率較高的重大公共衛生問題之一。2012～2015年我國18歲及以上居民高血壓患病粗率為27.9%(標化率23.2%)，患病率總體呈增高的趨勢〔1〕。高血壓是腦卒中、心肌梗死、腎功能不全最危險的因素，引發的靶器官損害嚴重危害人類健康〔2〕。腎臟參與血壓的調節，也是高血壓相關損害的重要靶器官。腎功能性障礙導致血壓升高，形成惡性循環，并加劇其他靶器官損害。早期干預高血壓進行性腎損害進程，阻斷高血壓-腎損害惡性循環，對控制血壓及延緩高血壓腎病的發生發展具有重要意義。研究表明，高血壓腎損害與激肽釋放酶激肽系統(KKS)聯系密切，KKS是機體重要的調節系統，廣泛地存在于組織和器官，在逆轉血管重構、減輕血管損傷后再狹窄及減輕腎損害等方面發揮保護作用〔3,4〕。降壓寶藍片由大黃、龍膽草、蘿芙木、黃芩等中藥組成，具有清瀉肝火、清利濕熱功效，用于肝火亢盛型高血壓治療，臨床療效確切，具有降壓及心、腦、腎靶器官保護作用。前期動物實驗表明：降壓寶藍片對自發性高血壓大鼠(SHR)有一定的降壓作用，對SHR血管、心臟重構有不同程度的改善作用〔5〕。本研究選用SHR為實驗動物，探討降壓寶藍片對SHR腎損害及KKS的影響，探討其可能的作用機制，為擴大其臨床應用范圍和進一步的深入研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 降壓寶藍片由河南省中醫藥研究院附屬醫院制劑室提供，批號20150902；馬來酸依那普利片，江蘇制藥股份有限公司，批號15061002。

1.2動物 SPF級12周齡雄性SHR大鼠30只，12周齡雄性京都種(WKY)大鼠10只，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-0001，動物合格證：NO.1150060133361。研究所涉及的動物相關操作符合河南省中醫藥研究院動物倫理委員會的規定。

1.3儀器及試劑 Synergy NEO型多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)，2K15型冷凍離心機(德國Sigma公司)，JXFSTPRP-cl全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)，Asp-303型自動脫水機、EG-1250C型組織包埋機、RM-2135型石蠟切片機、DM4000型光學顯微鏡、QWin V3病理圖像分析系統(德國Leica公司)，DYCP-24DN型電泳儀、DYCP-40C型轉膜儀(北京市六一儀器廠)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號325E038)，馬松三色(Masson)染色試劑盒(福州邁新生物技術有限公司，批號1508178004)，大鼠緩激肽原(BK)、低分子量激肽(LK)、組織激肽釋放酶(TK)、前列環素(PG)I2、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(江蘇卡爾文生物科技有限公司，批號E20160301A)，BK2型受體(B2R，上海圣克魯斯生物技術有限公司，批號sc-136216)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠，武漢三鷹生物技術有限公司(批號60004-1-Ig、SA00001-1)。

1.4方法

1.4.1分組與給藥 實驗動物適應性喂養1 w，隨機分為模型(SHR)組、依那普利組(0.02 g/kg)、降壓寶藍片組(0.6 g/kg)，在前期的主要藥效學研究中，共進行了3個劑量(1.2 g/kg、0.6 g/kg、0.3 g/kg)降壓和降脂實驗，本實驗選擇其中一個有效劑量(0.6 g/kg)進行靶器官保護作用機制研究。每組10只，以同齡同種系正常血壓的WKY大鼠10只作為正常對照(WKY)組。灌胃給藥，給藥體積10 ml/(kg·d)，連續12 w。WKY組和SHR組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。

1.4.2病理形態觀察 取腎冠狀切片，10%甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋，橫斷面切片，分別進行HE染色、Masson染色，觀察測量腎小球硬化指數(GSI)及腎組織間質膠原蛋白容積分數(CVF)。①GSI：腎小球硬化的定義為毛細血管腔塌陷和(或)玻璃樣變。采用Raij等〔6〕半定量方法評估腎小球硬化程度，每張切片觀察40個腎小球，根據腎小球硬化灶所占腎小球比例分為4級(0級：腎小球無病變；1級：腎小球受損<25%；2級：25%～50%腎小球受損；3級：51%～75%腎小球受損；4級：76%～100%腎小球受損)，根據不同級別腎小球硬化的例數，計算GSI。GSI=〔(1×N/40)+(2×N/40)+(3×N /40)+(4×N/40)〕×100。“N”表示不同級別的例數。②腎組織CVF：每張切片隨機選取10個高倍視野(×400)，分別測量膠原蛋白面積和視野總面積，取平均值計算CVF。CVF=膠原蛋白面積/視野總面積×100。

1.4.3腎組織BK、TK、LK和PGI2含量測定 末次灌胃給藥后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 g/kg)，腎組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀于450 nm波長處分別測定BK、TK、LK和PGI2樣品吸光度(A)，根據標準曲線的方程計算各樣品含量。

1.4.4腎組織B2R蛋白表達測定 制備分離膠，分離膠凝固后制備濃縮膠并插入梳子，待濃縮膠凝固后拔出梳子加入蛋白質樣品，接通電源開始電泳，電泳結束后按照纖維墊-濾紙-聚偏氟乙烯(PVDF)膜-分離膠-濾紙-纖維墊順序制作三明治，4℃，100 V轉膜120 min。轉膜結束后將PVDF膜放入封閉液中，37℃封閉1 h。4℃一抗過夜，TBST洗膜6 min×3次，孵二抗1 h，TBST洗膜6 min×3次，曝光并用Image Studio對條帶進行分析。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組腎組織病理形態學 WKY組腎小球、腎小管無明顯病理改變，可見少量膠原蛋白染色。SHR組可見腎小球體積縮小、塌陷及局灶性硬化，腎小管渾濁腫脹，基底膜增厚，偶見蛋白或紅細胞管型，腎間質充血，可見炎性細胞浸潤及間質纖維化，腎小球內及間質可見大量深染的膠原蛋白沉積。與SHR組比較，降壓寶藍片和依那普利組腎組織病理性改變及膠原蛋白沉積明顯減輕，GSI、CVF明顯降低(P<0.01)。見表1，圖1、2。

2.2各組腎組織KKS比較 與WKY組比較，SHR組腎組織BK、PGI2含量顯著降低(P<0.05)，TK含量有降低的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。與SHR組比較，降壓寶藍片組及依那普利組顯著升高腎組織PGI2含量(P<0.05，P<0.01)，降壓寶藍片組BK、TK、LK含量亦有升高的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，依那普利組顯著升高BK、TK(P<0.01)。見表1。

2.3降壓寶藍片對SHR腎組織B2R蛋白表達的影響 與WKY組比較，SHR組腎組織B2R蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與SHR組比較，依那普利及降壓寶藍片均能顯著上調B2R蛋白表達(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 各組腎組織GSI和CVF、KKS及B2R蛋白表達比較

圖1 各組腎組織形態學改變(HE染色，×200)

圖2 各組腎組織膠原蛋白改變(Masson染色，×200)

1～4：WKY組、SHR組、依那普利組、降壓寶藍片組圖3 各組腎組織B2R蛋白表達

3 討 論

高血壓是慢性腎臟病發生發展的主要危險因素之一，臨床上將高血壓造成的腎臟結構和功能的改變，稱為高血壓腎損害，亦稱高血壓性腎病。本研究結果顯示，SHR腎臟組織發生形態及結構上的病理變化：腎小球體積縮小、塌陷及局灶性硬化，內部間質有大量深染的膠原蛋白沉積，腎小管渾濁腫脹，基底膜增厚，腎間質充血，可見炎性細胞浸潤及間質纖維化，腎組織GSI、CVF顯著高于WKY組，符合高血壓腎損害病理特征，與文獻報道一致〔7,8〕。

腎臟局部KKS是腎-體液控制系統重要組成部分，KKS參與高血壓-腎損害病理生理過程，當其受抑制則可導致鈉潴留及高血壓的發生〔9〕。KKS是一種內源性代謝級聯系統，主要由激肽前體-激肽原、激肽釋放酶、激肽及激肽受體組成〔10〕。激肽原是活性激肽的前體，其中LK為一種β-球蛋白，分子量50～68 kD，主要存在于血漿和各種組織中。LK在TK催化下，釋放胰激肽(KD)和BK，TK是一種絲氨酸蛋白酶，它可以將低分子量的激肽原加工為具有生物活性的激肽和緩激肽，激肽具有血管活性，它可以觸發KKS的瀑布級聯反應〔11〕。BK是生理條件下主要的激肽類物質，是KKS發揮作用的主要成分，它是一種血管舒張因子。BK作用于血管內皮細胞膜B2R，使內皮細胞釋放一氧化氮(NO)和PGI2等活性物質，通過擴張小動脈、增加局部血流和血管通透性、抑制膠原蛋白、炎癥細胞及成纖維細胞聚集進而減輕血管重構及腎臟纖維化〔12〕。另一方面，BK還能促進水鈉排泄，具有強大的利尿鈉效應。靜脈或動脈注射BK，能迅速地擴張全身血管，降低外周血管阻力，抑制鈉水重吸收，增加腎小球濾過率，產生降壓效應〔13,14〕。另有研究表明，中藥能夠升高血清BK、TK的表達量，激活激肽釋放酶發揮降低血壓，改善血管重構，發揮靶器官保護作用〔15〕。本研究結果顯示，降壓寶藍片對SHR腎組織BK、TK、LK含量有升高的趨勢，能明顯升高腎組織中PGI2含量，顯著上調B2R蛋白表達，說明降壓寶藍片能發揮舒張血管效應，通過擴張小動脈，增加血管通透性和組織血流量，抑制膠原蛋白、平滑肌細胞增殖進而減輕血管重構及腎臟纖維化。

高血壓治療的根本目標是降低高血壓的心、腦、腎與血管并發癥發生和死亡的總危險〔1〕。中醫藥具有這方面的優勢，降壓寶藍片是河南省中醫藥研究院高血壓中心系列醫院制劑之一，用于肝火亢盛型高血壓治療。前期動物實驗研究發現，降壓寶藍片有減輕SHR左室肥厚及左室重構的作用〔5〕；臨床研究發現，降壓寶藍片可降低高血壓患者血漿同型半胱氨酸水平、左心室體積指數及頸動脈內膜中膜復合體厚度等指標，對左心室肥大和血管損傷有一定改善作用，可預防心血管事件及并發癥的發生〔16,17〕。

綜上，降壓寶藍片對SHR有腎保護作用，部分機制可能與上調KKS活性有關。