基于PI3K/PTEN/Akt信號通路探討Hp陽性萎縮性胃炎的作用機制

周海娟 陳剛 李枝錦 黃少君 王松海

(海口市中醫(yī)醫(yī)院，海南 海口 570216)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是一種臨床比較多見的一種慢性胃部疾病，胃黏膜的慢性炎癥和固有腺體萎縮是其主要的病理特征〔1〕。CAG 的發(fā)生與幽門螺旋桿菌(Hp)感染密切相關(guān)，流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，慢性胃炎中60%～80% 患者均顯示為Hp 陽性〔2〕。由于Hp 具有黏附性、運動性強等特點，極易產(chǎn)生抗生素耐藥，在治療上具有一定的難度，所以尋找新的作用靶點對于臨床防治CAG意義重大。第 10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)及磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)/ 蛋白激酶 B(Akt) 信號通路在調(diào)控細胞增殖、生長代謝等方面具有重要作用〔3,4〕。研究報道Hp 可能誘導(dǎo)PTEN高表達，并通過PI3K/Akt信號途徑抑制 Akt 磷酸化，促進胃黏膜細胞的凋亡〔5〕。本研究以PTEN/PI3K/Akt信號通路為作用靶點，探討其在Hp陽性CAG中的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1動物 70只8周齡SPF級Wistar 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK (湘) 2017-0003。

1.2試劑 胃蛋白酶測試盒、大鼠胃泌素(GAS)、胃蛋白酶原(PG)Ⅰ、PGⅡ試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；PI3K、Akt小分子RNA、PTEN慢病毒載體購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司；羊抗大鼠PI3K、PTEN、Akt、B細胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9、β-actin抗體購自美國 Santa Cruz 公司。

1.3儀器 低溫高速離心機〔賽默飛世爾科技(中國)有限公司〕；X73型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMOUS公司)；超聲勻漿器(日本SANYO公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.4大鼠Hp陽性萎縮性模型制備 取50只大鼠，灌胃抗生素溶液2 ml，連續(xù)3 d，1次/d，清除胃內(nèi)雜菌；第4天灌胃吲哚美辛1 ml，共2 d，1次/d，破壞胃黏膜屏障；第6天灌胃 50 g/L碳酸氫鈉溶液2 ml，15 min后灌胃Hp菌懸液(菌量為1×1012CFU/L)1 ml，隔日1次，共6次；間隔28 d后灌胃水楊酸鈉和乙醇混合溶液 2 ml，連續(xù)8 w，1次/d；灌胃前禁食12 h、灌胃4 h后進食。

1.5實驗分組 取10只健康大鼠作為對照1組，另外取10只Hp陽性CAG模型大鼠，檢測胃蛋白酶活性、胃液分泌量；血清GAS、PGⅠ、PGⅡ水平； 取胃黏膜組織檢測PI3K、PTEN、Akt蛋白表達。取10只健康大鼠作為對照2組，另外取40只Hp陽性CAG模型大鼠，隨機分為陰性對照(NC)組，PI3K基因沉默(sh-PI3K)組，Akt基因沉默(sh-Akt)組、PTEN過表達(miR-PTEN)組，每組10只。NC、miR-PTEN通過尾靜脈分別注射空白載體及PTEN慢病毒載體，sh-PI3K、sh-Akt組通過尾靜脈注射PI3K-shRNA、Akt-shRNA，連續(xù) 2 次，每月 1 次。檢測胃蛋白酶活性、胃液分泌量；血清GAS、PGⅠ、PGⅡ水平；Hp 檢測胃組織 Hp 陽性率；取胃黏膜組織檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9 表達。

1.6檢測指標

1.6.1測定胃蛋白酶活性及胃液分泌量 實驗結(jié)束后，10% 水合氯醛腹腔注射，大鼠麻醉后仰位固定，墊高頭部，暴露胃部，在幽門下方 0.3 cm 處結(jié)扎，5 h 后剪開結(jié)扎處，收集胃液，4 000 r/min離心15 min，測量上清液體積，取2 ml上清液，13 000 r/min離心10 min，取上清液，測定胃蛋白酶活性。

1.6.2檢測血清中 PGⅠ、PGⅡ、GAS水平 大鼠麻醉后腹主動脈采血，3 500 r/min離心 15 min，取血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測PGⅠ、PGⅡ及GAS水平，計算PGⅠ/PGⅡ比值。測定時嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6.3檢測Hp 陽性情況 大鼠麻醉后剖腹，摘出全胃，沿胃大彎剪開，取前后胃竇部及部分胃體胃壁3 mm×10 mm，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察Hp 陽性情況。

1.6.4Western印跡檢測胃組織PI3K、PTEN、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白表達 取大鼠胃組織，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液充分勻漿，離心15 min(4℃、12 000 r/min)，BCA蛋白定量法測定上清液蛋白濃度，加上樣緩沖液和樣品，上樣量100 μg蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂、封閉后，加入一抗PI3K、PTEN、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9、β-actin，4℃ 孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗，室溫孵育 2 h，TBST 洗滌， 電化學發(fā)光(ECL)顯影并掃描，化學發(fā)光儀成像。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1胃液分泌量及胃蛋白酶活性 與對照1組相比，模型組胃蛋白酶活性明顯降低，胃液分泌量明顯減少(P<0.05)，見表1。

2.2血清PGⅠ、PGⅡ及GAS水平 與對照1組相比，模型組血清PGⅠ/PGⅡ比值、GAS含量明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.3PI3K、Akt、PTEN蛋白表達 與對照1組相比，模型組胃組織PI3K、Akt 蛋白表達明顯升高，PTEN蛋白表達明顯降低(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組胃蛋白酶活性及胃液分泌量、血清PGⅠ/PGⅡ、GAS水平、胃組織PI3K、Akt、PTEN蛋白表達

圖1 Hp陽性CAG大鼠胃組織PI3K、Akt、PTEN蛋白表達

2.4調(diào)節(jié)PI3K、Akt、PTEN表達后胃蛋白酶活性及胃液分泌量 與對照2組比較，NC組胃蛋白酶活性明顯降低，胃液分泌量明顯減少(P<0.05)；與NC組比較，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN組胃蛋白酶活性明顯升高，胃液分泌量明顯增加(P<0.05)，見表2。

2.5調(diào)節(jié)PI3K、Akt、PTEN表達后血清PGⅠ/PGⅡ、GAS水平 與對照2組比較，NC組血清PGⅠ/PGⅡ、GAS含量顯著降低(P<0.05)；與NC組比較，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN組血清PGⅠ/PGⅡ、GAS含量顯著升高(P<0.05)，見表2。

2.6調(diào)節(jié)PI3K、Akt、PTEN表達后胃組織 Hp 陽性情況 與對照2組比較，NC組胃組織 Hp 陽性率明顯升高(P<0.05)；與NC組比較，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN組胃組織 Hp 陽性率明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.7調(diào)節(jié)PI3K、Akt、PTEN表達后胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表達 與對照2組比較，NC組胃組織Bcl-2、Bax、Caspase-9表達明顯升高(P<0.05)；與NC組比較，sh-PI3K、sh-Akt、miR-PTEN組胃組織Bcl-2、Bax、Caspase-9表達明顯降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 各組胃蛋白酶活性及胃液分泌量、PGⅠ/PGⅡ、GAS水平、胃組織Hp陽性率、胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表達

1～4：對照2組、NC組、sh-PI3K組、sh-Akt組、miR-PTEN組圖2 調(diào)節(jié)PI3K、Akt、PTEN表達后胃黏膜組織Bcl-2、Bax、Caspase-9 蛋白表達

3 討 論

PI3K/Akt 信號通路由 PI3K、Akt 及下游相關(guān)分子組成，PI3K 通過調(diào)控磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抑制細胞凋亡的作用〔6,7〕，而PIP3 又會導(dǎo)致 PI3K/Akt 信號通路的失衡，進而介導(dǎo) NF-κB 等炎癥因子的釋放、抑制細胞的凋亡〔8,9〕。PTEN 可以調(diào)控多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有促進細胞凋亡、降低細胞存活率、調(diào)控細胞周期等作用〔10〕。PTEN 作為PI3K/Akt 信號通路的重要負性調(diào)控因子，可以拮抗 PI3K的作用，它通過下調(diào) PIP3 水平，使得PI3K功能喪失，從而對 PI3K/Akt 通路介導(dǎo)的細胞凋亡起調(diào)控作用〔11,12〕。諸多研究報道，在 Hp 所致的胃黏膜損傷過程中，增殖和凋亡的紊亂是關(guān)鍵原因〔5〕。Hp 可能誘導(dǎo) PTEN高表達，并通過PI3K/Akt 信號途徑促進胃黏膜細胞的凋亡〔13〕，Dunn 等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，Hp培養(yǎng)上清液可以抑制胃黏膜上皮細胞的增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能是誘導(dǎo)PTEN 高表達，并通過 PI3K/Akt 信號途徑抑制 Akt 磷酸化。Tsugawa 等〔15〕研究顯示，PTEN 過表達后，可抑制 PI3K/Akt 信號通路的激活，從而導(dǎo)致門脈高壓性胃黏膜愈合延遲。PG可以反映胃體黏膜的泌酸功能，胃體萎縮時會影響 PGⅠ的分泌情況〔16,17〕；GAS可以促進胃酸分泌，保護和營養(yǎng)胃腸道黏膜，CAG患者由于胃分泌功能不足，GAS 分泌減少，因此，GAS含量也可以反映胃黏膜萎縮的情況〔18〕。

本研究說明Hp陽性CAG的發(fā)病可能與PI3K、Akt、PTEN表達異常有關(guān)，PI3K、Akt、PTEN可以通過調(diào)控胃黏膜上皮細胞增殖、凋亡等途徑參與Hp陽性CAG病變的發(fā)生。