舒洛地特對糖尿病足潰瘍大鼠HIF-1α/GPER/VEGF通路及創面愈合的影響

韋積華 羅富強 謝康麒 李載永 余電柏 麻華德 丁科 羅群強

(右江民族醫學院 1附屬醫院手足外科，廣西 百色 533000；2臨床醫學院)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，近年來發病人數急劇增加，據國際糖尿病聯盟調查顯示，全球20～79歲成人群體中糖尿病患者高達4.630億例，預計2045年可能增長至7.002億例，其中，我國糖尿病患者例數居全球首位〔1〕。糖尿病患者體內長期的高糖環境會引發大量并發癥，糖尿病足潰瘍(DFU)是其嚴重并發癥之一〔2〕。研究表明，糖尿病患者長期高血糖會出現不同程度的微血管病變，約15%會引起下肢肢體潰瘍，且潰瘍難以愈合，15%～20%的DFU患者會發展至截肢，嚴重影響患者生活質量〔3，4〕。G蛋白耦聯雌激素受體(GPER)是近年來發現的膜雌激素受體，可調節多個信號轉導通路，在腫瘤中可調控低氧誘導因子(HIF)-1α/血管內皮生長因子(VEGF)通路，誘導微血管環境形成〔5，6〕。有研究發現，定向激活HIF-1對糖尿病小鼠皮膚創傷修復具有促進作用，可能與調控VEGF水平升高有關〔7〕。舒洛地特屬于葡糖胺聚糖，主要由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮膚素組成，具有抗感染、降血脂、抗心血管疾病等作用，在糖尿病腎病中能保護并重建損傷的血管內皮〔8，9〕。本研究建立DFU大鼠模型，探討舒洛地特對HIF-1α/GPER/VEGF通路及創面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑和儀器 雄性SD大鼠，體重200～250 g，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0010。主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)、RIPA裂解液(貨號：S27190-1g、AR0010-100 ml)購自上海吉至生化科技有限公司；舒洛地特(批準文號：H20140120)購自ALFA WASSERMANN S.p.A.，大鼠白細胞介素(IL)-6、IL-8酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：ZN2880-GPK、ARB12173)購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(貨號：ER1393)購自武漢菲恩生物科技有限公司；蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號：DH0006)購自北京雷根生物技術有限公司；HIF-1α抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(貨號：ab179483、ab186930、ab6721)購自Abcam公司；GPER抗體(貨號：NLS4271)購自Novus Biologicals；VEGF抗體(貨號：19003-1-AP)購自Proteintech。主要儀器:離心機(型號：5427R)購自德國Eppendorf公司；酶標儀(型號：SynergyH1)購自美國BioTek公司；顯微鏡(型號：CKX41SF)購自日本Olympus公司；凝膠成像系統(型號：Alpha View)購自美國Protein Simple公司。

1.2動物分組及造模〔10〕大鼠適應性喂養1 w，隨機選取8只作為對照組，其余大鼠建立DFU模型。建模大鼠給予高糖高脂飼料喂養，對照組大鼠給予普通飼料喂養。4 w后，建模大鼠按30 mg/kg給予1% STZ溶液(用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制)腹腔注射1次，對照組大鼠給予等體積0.1 mol/L檸檬酸緩沖液腹腔注射1次。3 d后，測量空腹血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。此后，建模大鼠改用普通飼料喂養。造模成功的大鼠及對照組大鼠給予10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，制備潰瘍創面：在大鼠雙后足背部，用磁鐵壓出3 mm×7 mm的矩形全層皮膚缺損，達到實驗動物創面潰瘍的慢性損傷程度即為DFU造模成功。模型大鼠隨機分為模型組和舒洛地特低、中、高劑量組，每組8只。

1.3動物給藥 造模結束當天分別對舒洛地特低、中、高劑量組大鼠給予5、10、20 mg/kg舒洛地特〔11〕腹腔注射，對照組、模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，1次/d，連續給藥14 d。給藥0、3、7、14 d時，檢測大鼠隨機血糖。

1.4大鼠創面愈合情況 分別于給藥7、14 d對大鼠足背創面拍照，采用Image軟件計算其面積，計算創面愈合率。創面愈合率=(初始創面面積-當前測量面積)/初始創面面積×100%。

1.5ELISA檢測血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達 給藥結束后，各組大鼠采集尾靜脈血，3 000 r/min離心分離上清液。按照IL-6、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測吸光度(OD)值。配制IL-6、IL-8和TNF-α標準溶液，使用酶標儀檢測OD值，繪制標準曲線。根據血清樣品OD值與標準曲線方程計算血清IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.6HE染色觀察創面組織病理變化 各組大鼠剪取創面部位及周圍3 mm的組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸去水分，分為兩份，一份置于-80℃低溫保存；另一份用10%甲醛溶液固定，用石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡觀察創面組織病理變化。

1.7Western印跡法檢測創傷組織HIF-1α/GPER/VEGF通路相關蛋白表達 將-80℃低溫保存的創面組織于冰上解凍，剪碎，加含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上研磨、勻漿，12 000 r/ min離心15 min，分離上清，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測蛋白濃度，取樣品與上樣緩沖液混合，沸水煮沸5 min使蛋白變性，向十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣孔加高溫變性的蛋白樣本，電泳、濕轉，5%脫脂奶粉封閉2 h，將帶有目的蛋白條帶的膜放在相應一抗(HIF-1α抗體、GPER抗體、VEGF抗體、GAPDH抗體，均1∶1 000稀釋)稀釋液中4℃孵育過夜，洗膜，放在二抗(HRP標記的羊抗兔lgG，1∶2 000稀釋)稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜，ECL發光顯影，凝膠成像系統拍照，分析條帶灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1給藥過程中各組血糖水平變化 給藥0、3、7、14 d，與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組血糖水平均顯著升高(P<0.05)；給藥3、7、14 d，與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組血糖水平均顯著降低(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，血糖水平逐漸降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.2給藥過程中各組大鼠創面愈合情況 給藥7、14 d，與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組大鼠創面愈合率均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組大鼠創面愈合率均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，大鼠創面愈合率逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達變化 與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平均顯著降低(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組創面組織病理變化 對照組創面組織中存在少量炎癥細胞及大量膠原纖維、肉芽組織及新生毛細血管；模型組創面組織中有大量炎癥細胞浸潤，可見少量膠原纖維沉積及肉芽組織、新生毛細血管生長；隨著舒洛地特的使用及劑量的升高，創面組織炎癥細胞浸潤程度逐漸減輕，膠原纖維沉積及肉芽組織、新生毛細血管數量逐漸增多。見圖1。

表1 各組血糖水平及創面愈合率比較

表2 各組血清中IL-6、IL-8和TNF-α表達水平及創面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平比較

圖1 各組創面組織病理變化(HE染色，×200)

2.5各組創面組織中HIF-1α/GPER/VEGF通路相關蛋白表達 與對照組相比，模型組和舒洛地特低、中、高劑量組創面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，舒洛地特低、中、高劑量組創面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；隨著舒洛地特劑量的升高，大鼠創面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達水平逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

1～5:對照組、模型組、舒洛地特低劑量組、舒洛地特中劑量組、舒洛地特高劑量組圖2 各組創面組織中HIF-1α、GPER、VEGF蛋白表達

3 討 論

潰瘍創面愈合是多種因素共同作用的結果，組織受損愈合時伴有肉芽組織形成，而新生血管是肉芽組織的重要組成部分，通過提供血氧供應在創面愈合過程發揮作用，血管生成數量及生成速度均對創面愈合有影響〔12〕。但血管內皮細胞損傷及功能異常是糖尿病并發血管病變的早期改變之一，會導致血液流通變緩，當糖尿病大鼠出現創傷后，血管內皮細胞增殖積極，但無法有效形成功能毛細血管，影響創面血氧供應，導致創面愈合困難〔13，14〕。本研究結果提示，DFU大鼠模型建立成功，DFU大鼠創傷更難愈合，炎癥反應更加嚴重，且難以生成新生毛細血管。

舒洛地特是臨床上的一種新型葡糖胺聚糖制劑，既往報道其具有抑制炎癥反應及保護血管內皮細胞的作用〔15，16〕。本研究結果提示，舒洛地特能降低大鼠血糖水平，降低炎癥反應，促進創面組織中新生毛細血管生成，能幫助DFU大鼠創面愈合，但涉及的相關作用機制還需進一步探究。

HIF-1α、VEGF均為重要的血管生成生長因子，有助于積極改善糖尿病創面的新生血管形成及愈合效果〔17〕。糖尿病狀態對HIF-1α的轉錄、翻譯具有抑制作用，糖尿病創面組織由于相對缺氧，其愈合過程伴隨HIF-1α表達的增加，同時HIF-1α表達因高血糖環境而受到抑制，導致糖尿病創面愈合較非糖尿病緩慢〔18〕。本研究結果提示，DFU大鼠體內高血糖環境抑制了發生創傷后的HIF-1α蛋白表達。VEGF是特異性作用于血管內皮細胞的細胞因子，能誘導新生血管形成，同時是HIF-1α的下游基因，可被HIF-1α誘導表達〔19〕。本研究亦發現，DFU大鼠體內高血糖環境會抑制創面組織中VEGF蛋白表達，導致新生毛細血管生成減少。GPER是近年來發現的雌激素受體，在缺血性腦卒中中，其能通過調節HIF-1α表達發揮神經保護作用，在腫瘤中也可調節HIF-1α/VEGF通路誘導形成腫瘤微血管環境〔5，20〕。本研究結果提示，DFU大鼠體內高血糖環境會抑制HIF-1α/GPER/VEGF通路，最終影響創面組織新生毛細血管生成，導致創面愈合變慢。而隨著舒洛地特的使用及劑量的升高，舒洛地特可呈劑量依賴性降低血糖水平，減輕高血糖環境對HIF-1α/GPER/VEGF通路的抑制，恢復創面組織新生毛細血管生成。

綜上，舒洛地特可降低DFU大鼠血糖水平，同時抑制炎癥反應并激活HIF-1α/GPER/VEGF通路，促進創面組織新生毛細血管生成及創面愈合。