芒柄花素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制

盧迎宏 王丹 井海云 王夢(mèng)超 包曉青

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 鄭州 450007)

心血管疾病在全球范圍內(nèi)均具有較高的病死率，其中急性心肌梗死發(fā)病極其兇險(xiǎn)，多數(shù)患者預(yù)后不良〔1〕。目前主要通過(guò)溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入等手段恢復(fù)血流，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后再恢復(fù)灌注時(shí)，部分患者表現(xiàn)出心肌缺血癥狀加重，甚至出現(xiàn)大面積壞死的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷〔2〕。因此，減少心肌缺血再灌注損傷是臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的重難點(diǎn)。芒柄花素是從黃芪、狼麻植物的根中分離提取的一種異黃酮類(lèi)化合物，又稱(chēng)刺芒柄花素、芒柄花黃素，具有抗腫瘤、降血脂、抗心律不齊、抗菌、解痙攣、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、雌性激素等多種藥理活性〔3，4〕。研究表明，芒柄花素能改善糖尿病小鼠心肌損傷〔5〕。但芒柄花素是否可以保護(hù)心肌缺血再灌注損傷尚不清楚。本研究通過(guò)建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察芒柄花素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并分析其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2019-0120，各項(xiàng)動(dòng)物操作均符合3R原則。

1.2藥品與主要試劑 芒柄花素(純度>98%，北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)，維拉帕米(鹽酸維拉帕米片，天津市中央藥業(yè)有限公司)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-Mb)、肌紅蛋白(Mb)、心肌肌鈣蛋白(cTn)I、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蘇木素-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物歧化酶(GSH-Px)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、細(xì)胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2、p-Nrf2及血紅素加氧酶(HO)-1抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

1.3心肌缺血再灌注損傷模型的制備〔6〕采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，具體操作如下：腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，連接動(dòng)物呼吸機(jī)和心電監(jiān)護(hù)儀，胸骨左緣3～4肋間開(kāi)口，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，再經(jīng)淺層心肌穿出，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min，當(dāng)心電監(jiān)護(hù)儀顯示ST段抬高和或T波高聳，且觀察到縫線遠(yuǎn)心端心外膜顏色發(fā)絳，提示心肌缺血成功。再松開(kāi)縫線120 min，若心電監(jiān)護(hù)儀顯示ST段下降>50%，心外膜顏色復(fù)原，提示心肌缺血再灌注損傷大鼠模型復(fù)制成功。

1.4分組與給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芒柄花素低、中、高劑量組及維拉帕米組(陽(yáng)性對(duì)照)，每組10只。除假手術(shù)組外，其余各組均構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術(shù)組僅暴露心臟、穿線，但不結(jié)扎。芒柄花素低、中、高劑量組分別灌胃10、20、40 mg/kg芒柄花素〔7〕，維拉帕米組灌胃20 mg/kg維拉帕米〔8〕，1次/d，連續(xù)給藥4 w，假手術(shù)組和模型組以等體積生理鹽水替代。末次給藥24 h后，斷頭法處死大鼠，迅速分離心肌組織，部分固定于4%多聚甲醛液中，剩余凍存于液氮中待測(cè)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1心肌損傷標(biāo)志物 取心肌組織，以質(zhì)量∶體積為1∶9添加預(yù)冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物CK-Mb、Mb及cTnI含量。

1.5.2心肌組織病理?yè)p傷 取固定的心肌組織，制備4 μm石蠟切片，脫蠟、水化后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察大鼠心肌組織病理?yè)p傷情況。

1.5.3炎癥因子 取心肌組織，以質(zhì)量∶體積比為1∶9添加預(yù)冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)心肌組織中炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β含量。

1.5.4氧化應(yīng)激標(biāo)志物 以質(zhì)量∶體積比為1∶9添加預(yù)冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，根據(jù)生化試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD、MDA及GSH的含量。

1.5.5Akt/Nrf2/HO-1信號(hào)通路 取適量心肌組織，添加蛋白裂解液提取總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度后，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小選擇適宜的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)濃度，電泳至蛋白完全分離后再電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后浸沒(méi)于含有5%脫脂奶粉的封閉液，室溫下反應(yīng)2 h，接著置于一抗中4℃孵育過(guò)夜，分別添加Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Nrf2(1∶500)、p-Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶2 000)及內(nèi)參Actin(1∶1 000)，次日再添加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶8 000)，37℃反應(yīng)1 h，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。以p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2表示其相對(duì)表達(dá)量，HO-1條帶灰度值與內(nèi)參Actin條帶灰度值比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1芒柄花素對(duì)心肌損傷標(biāo)志物的影響 與假手術(shù)比較，模型組CK-Mb、Mb、cTnI均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組CK-Mb、Mb、cTnI均明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標(biāo)的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2芒柄花素對(duì)心肌炎癥因子水平的影響 與假手術(shù)比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β均明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標(biāo)的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 芒柄花素對(duì)心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子水平的影響

2.3芒柄花素對(duì)心肌病理?yè)p傷的影響 假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；模型組心肌細(xì)胞核溶解、固縮，肌纖維紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；芒柄花素低、中、高劑量組和維拉帕米組心肌損傷較模型組有明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見(jiàn)圖1。

圖1 芒柄花素對(duì)心肌病理?yè)p傷的影響(HE染色，×200)

2.4芒柄花素對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響 與假手術(shù)比較，模型組SOD、GSH-Px明顯降低，MDA明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組SOD、GSH-Px明顯升高，MDA明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.5芒柄花素對(duì)Akt/Nrf2/HO-1表達(dá)的影響 與假手術(shù)比較，模型組p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表達(dá)明顯升高(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 芒柄花素對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物及Akt/Nrf2/HO-1表達(dá)的影響

1～6：假手術(shù)組、模型組、芒柄花素低劑量組、芒柄花素中劑量組、芒柄花素高劑量組、維拉帕米組圖2 各組Akt/Nrf2/HO-1表達(dá)

3 討 論

左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法是經(jīng)典的心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，CK-Mb、Mb、cTnI是反映心肌損傷的敏感指標(biāo)〔9〕，本研究結(jié)果提示，芒柄花素可減輕心肌缺血再灌注損傷。目前，心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，但炎癥因子在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有關(guān)鍵作用，缺血損傷會(huì)刺激中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子，這些炎性細(xì)胞及因子的聚集會(huì)引起血管堵塞。同時(shí)，TNF-α還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)過(guò)氧化物陰離子促進(jìn)髓過(guò)氧化物酶的合成，從而放大炎癥反應(yīng)，IL-6、IL-1β作為強(qiáng)效的促炎因子，持續(xù)升高會(huì)進(jìn)一步加重迅疾損傷〔10，11〕。Yang等〔12〕研究顯示，芒柄花素可以過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α依賴方式，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)，改善肝臟膽汁淤積，從而保護(hù)肝損傷。本研究中芒柄花素可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的過(guò)度表達(dá)，提示芒柄花素減輕心肌缺血再灌注損傷可能與減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

同時(shí)，心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，而心肌細(xì)胞中富含線粒體，是病理下活性氧的主要來(lái)源〔13〕。正常情況下，體內(nèi)抗氧化和氧化水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，外界刺激引起心肌損傷后，體內(nèi)分泌的SOD、GSH-Px等抗氧化酶不足以清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致氧化反應(yīng)終末產(chǎn)物MDA明顯增加，加劇線粒體損傷〔14〕。本研究結(jié)果提示，芒柄花素可減輕氧化應(yīng)激水平，保護(hù)心肌損傷，這與Li等〔15〕報(bào)道芒柄花素在創(chuàng)傷性腦損傷中的抗氧化應(yīng)激作用相似。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt通路是機(jī)體重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且很多植物提取物可通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt通路發(fā)揮保護(hù)心肌的作用〔16，17〕。同時(shí)，Akt的活化可增強(qiáng)下游Nrf2活性，促進(jìn)抗氧化物質(zhì)HO-1的表達(dá)，從而提升細(xì)胞的抗氧化作用〔18〕。Aladaileh等〔19〕研究指出，芒柄花素可保護(hù)甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腎臟損傷，減輕大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平，可能與上調(diào)Nrf2/HO-1通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷大鼠中Akt/Nrf2/HO-1通路處于抑制狀態(tài)，芒柄花素給藥后可逆轉(zhuǎn)這種抑制，提示芒柄花素可能通過(guò)促進(jìn)Akt/Nrf2/HO-1表達(dá)，起到保護(hù)心肌損傷的作用。

綜上，芒柄花素可保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，可能與上調(diào)Akt/Nrf2/HO-1表達(dá)有關(guān)，并且以高劑量效果最好。芒柄花素作為一種來(lái)源廣泛的植物提取物，對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用將為心缺血性疾病的治療提供新思路，但其上下游具體調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。