銀杏葉提取物(EGb-761)誘導MDA-MB-231細胞凋亡的分子機制

劉培培 馮趙慧子 嚴金玲 曾雪亮 潘靜 高暢

(1贛南醫學院第一附屬醫院藥學部，江西 贛州 341000；2贛州市人民醫院康復醫學科)

乳腺癌是一種常見于女性的腫瘤〔1〕，根據最新報告顯示，2020年乳腺癌全球新發病例高達226萬例，超越肺癌成為全球第一大癌癥〔2〕。目前，對于乳腺癌轉移臨床上多采用手術治療，放化療輔助術后治療，但治療效果較為一般，經常發生腫瘤復發和轉移的情況〔3〕，因此，尋找一種防治癌癥的復發轉移、降低放化療毒副作用的抗癌藥物十分必要。銀杏葉提取物(EGb-761)為傳統中藥材銀杏葉中提取的活性成分，具有低毒高效的特點，已有學者將其用于治療神經損傷、肝損傷及腎代謝等疾病〔4，5〕，但銀杏葉提取物對腫瘤尤其是人乳腺癌治療效果的研究報道較少，其分子機制尚不十分明確。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路和細胞活動密切相關，已被研究證實與多種人類腫瘤存在關聯，其活性異常會使細胞周期紊亂，導致正常細胞向腫瘤細胞轉換〔6，7〕。本研究觀察EGb-761對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的影響，并基于PI3K/Akt通路探討EGB-761抗腫瘤作用的機制。

1 材料與方法

1.1細胞株與EGb-761 MDA-MB-231細胞(購自協和細胞庫)；EGb-761(17.5 mg/5 ml，臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司，批號：M4073)。

1.2試劑與儀器 RPMI1640培養基、青鏈霉素購自同田科技有限公司；蛋白胰酶購自GEN-VIEW科技有限公司；標準胎牛血清購自愛必信生物有限公司；噻唑藍(MTT)試劑盒、transwell小室、基質膠、凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、PI3K、p-Akt 、Akt和β-actin抗體及山羊抗兔IgG購自成都正能生物有限公司；Elx800酶標儀購自BioTek公司；Western 濕電轉膜儀購自美國BD公司；S3e流式細胞儀購自美國Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購自美國Leica公司。

1.3細胞培養及分組 MDA-MB-231細胞在培養基中(含10%胎牛血清，1%的青鏈霉素)，于37℃、5%CO2溫箱中孵育，2～3 d傳代1次，3代后用于實驗。根據銀杏葉提取物EGb-761處理的濃度分為低(656.25 μg/ml)、中(1 093.75 μg/ml)、高濃度(1 531.25 μg/ml)組，以不含EGb-761的溶劑處理細胞為對照組。

1.4MTT法檢測MDA-MB-231細胞抑制率 取對數期細胞，濃度控制為1×105個/ml。對照組和EGb-761組每孔加入100 μl細胞懸浮液，調零組加培養基，小孔周圍加PBS，于5%CO2，37℃培養箱中孵育24 h。根據分組加藥處理，調零組加等量培養基，繼續培養24 h。各組加MTT溶液20 μl，繼續孵育4 h。吸出上清，每孔200 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分融解，上酶標儀測定各孔光OD490 nm值，記錄結果并計算各復孔的細胞抑制率，每組設5個復孔。細胞抑制率=(OD對照-ODEGb-761)/(OD對照-OD調零)×100%。

1.5細胞遷移實驗 取對數期細胞，0.25%胰酶消化，離心，重懸細胞，調整細胞密度為2×105/ml。按上述細胞分組處理，上室加入100 μl處理好細胞懸液，下室加入含20%血清的培養基，放5% CO2，37℃培養箱中孵育24 h。取出小室，吸去溶液，4%甲醛固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色10 min左右，清洗。用棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細胞，取5個方向隨機視野，顯微鏡下計數，計算取平均值。

1.6細胞侵襲實驗 取稀釋的人工基質膠125 μl加入transwell板上室，平攤覆蓋至膜上，然后在溫箱中放置30 min，使人工基質膠聚合。取對數期待測細胞，調整濃度為2×105個/ml，上室接種處理后MDA-MB-231細胞懸液，下室用初始的培養基做趨化因子。后續步驟同1.5遷移實驗，顯微鏡下計數，計算取平均值。

1.7倒置顯微鏡下形態觀察 取對數期細胞，接種于24孔板并控制密度為1×105個/孔，培養細胞，按1.3描述方法進行分組處理，繼續培養48 h，顯微鏡下觀察乳腺癌細胞形態。

1.8雙染法檢測細胞凋亡 取對數期細胞，接種到6孔板中，每孔約2×105個細胞。置于溫箱中，根據分組處理，繼續培養48 h。以0.25%胰酶消化細胞，離心后棄上清。4℃預冷的70%乙醇固定，調整細胞濃度為1×106個/ml，加入染色劑10 ml，置于4℃冰箱中染色30 min，流式細胞儀檢測凋亡情況，細胞凋亡率(%)=凋亡細胞/細胞總數×100%計算。

1.9Western印跡檢測PI3K/Akt通路蛋白表達 取對數期細胞同上處理分組，培養48 h，收集各組細胞加入細胞液裂解15 min，用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度。將樣品放在沸水中加熱至蛋白完全變性，拿出樣品冷卻至室溫，取30 μg進行電泳，濕轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常溫下以5%脫脂牛奶封閉2 h，后用TBST清洗3次，一抗caspase-3、PARP、p-GSK-3β、GSK-3β、PI3K、p-Akt、Akt(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜，DyLight 800標記的二抗(1∶2 000)常溫下孵育1 h，PVDF清洗膜3次后，用化學發光法進行顯影處理，拍照，用ImageJ(v1.7.0)軟件對實驗所得條帶進行定量分析，以β-actin作為內參蛋白，相對表達量=目標蛋白灰度值/參照蛋白灰度值。

1.10統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1EGb-761對細胞抑制率的影響 對照組和EGb-761低、中、高組的抑制率依次為(0.00±0.00)%、(27.28±5.66)%、(48.05±4.90)%、(80.30±4.00)%，各組差異均有統計學意義，且EGb-761對DA-MB-231細胞抑制作用呈濃度依懶性(均P<0.05)。

2.2EGb-761對細胞遷移的影響 對照組和EGb-761低、中、高組的遷移個數分別為(379.40±27.46)個、(348.80±17.08)個、(288.00±16.23)個、(224.00±11.38)個，與對照組比較，EGb-761各劑量組細胞穿透數量顯著減少，且呈劑量依賴，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3EGb-761對細胞侵襲能力的影響 對照組和EGb-761低、中、高組的細胞數分別為(272.60±15.37)個、(208.80±16.21)個、(127.20±11.12)個、(69.80±10.66)個。與對照組比較，EGb-761組細胞侵襲數量明顯減少，且呈劑量依賴，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖1。

2.4EGb-761對細胞形態的影響 對照組MDA-MB-231細胞為細長不規則狀，間隙較小，分布密集。加入EGb-761培養48 h后，細胞間隙增大，密度顯著降低，貼壁生長細胞開始脫壁，胞質出現渾濁，細胞外形收縮呈片狀球狀，出現細胞腫脹破裂情況，提示處理后細胞會明顯發生凋亡，見圖2。

2.5EGb-761對細胞凋亡的影響 對照組和EGb-761低、中、高組的細胞凋亡率分別為(2.15±0.41)%、(23.23±2.07)%、(44.69±4.12)%，(65.78±5.26)%。與對照組比較，EGb-76組細胞凋亡率明顯升高，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見圖3。

2.6各組PI3K/Akt通路蛋白水平測定 與對照組比較，EGb-761處理后各組PARP和PI3K蛋白含量均明顯降低，caspase-3含量顯著升高，p-GSK-3β和p-Akt水平顯著下降，且EGb-761劑量越高效果越顯著(均P<0.05)。見表1、圖4。

圖1 各組細胞遷移及侵襲(結晶紫染色，×200)

圖2 各組MDA-MB-231細胞細胞形態變化(結晶紫染色，×200)

圖3 各組細胞凋亡率

表1 各組PI3K/Akt通路蛋白表達

1～4：對照組、EGb-761低濃度組、EGb-761中濃度組、EGb-761高濃度組圖4 各組PI3K/Akt通路蛋白Western印跡檢測

3 討 論

細胞的增殖和凋亡是非常重要的生理過程，正常情況下細胞的增殖會受到自身限制，細胞凋亡表現穩定。但在癌細胞中這些平衡會被打破，細胞增殖速度異常并失去控制，凋亡途徑被阻斷，使得癌細胞非常具有危險性〔8〕。

在分子層面上，PI3K/Akt通路參與調節多種細胞生理功能，而乳腺癌的產生和細胞活動的異常存在直接的關系，二者之間存在的一定的聯系〔9，10〕。PI3K 是一種異源二聚體酶，多種信號因子都可以使PI3K活化〔11，12〕。活化的PI3K通過特異性催化激活胞膜上的PIP3，從而靶向調控Akt。Akt是PI3K重要的下游效應蛋白〔13〕，活化后的Akt可以通過作用于PARP、GSK-3β、caspase-3等因子，進而調節細胞的功能，與腫瘤的形成發展有緊密的關聯〔14，15〕。作為PI3K/Akt的下游分子的PARP蛋白是一種DNA修復酶，在細胞凋亡調控中發揮著十分重要的作用，其主要通過內源性途徑調節細胞凋亡，PARP的剪切與caspase-3活化也存在密切關聯。caspase-3在細胞凋亡有著重要的作用，研究表明，PI3K/Akt信號通過caspase-3蛋白，引起促凋亡蛋白B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白(Bax)從細胞質向線粒體外膜移位，破壞線粒體膜的完整性，降低膜電位，使得細胞開始凋亡。GSK-3β是一種普遍存在細胞中的調控糖原合成酶，活化的GSK-3β蛋白作用與多種信號分子，可以調節細胞的多種生命活動，但在在腫瘤細胞中GSK-3β代謝會產生異常，使得機體紊亂。有研究表明，PI3K/Akt信號通過caspase-3蛋白〔16〕。

本研究結果說明，EGb-761通過PI3K/Akt信號通路下調腫瘤細胞中PARP和PI3K的表達，上調caspase-3的表達，進而誘導MDA-MB-231細胞的凋亡。EGb-761中的主要有效成分為銀杏黃酮類化合物。研究認為，包括EGb-761在內的多種黃酮類化合物具有抗氧化作用，同時可以影響體內金屬離子平衡，調節代謝狀態，近幾年隨著研究愈加深入，發現EGb-761在分子水平上也有巨大的影響作用，可以調控多個信號通路〔17〕。亢璐等〔18〕研究發現，EGb761可以通過血管內皮生長因子(VEGF)/PI3K/Akt1通路清除氧自由基，從而改善大鼠創傷性腦水腫；劉鐵鋼等〔19〕在報告中指出，EGb-761對甲狀腺癌TPC-1細胞株的抗腫瘤效果與調控PI3K/Akt信號通路密切相關〔19〕。在EGb-761所屬的黃酮類化合物研究中也有相應的結果，韋飛燕等〔20〕研究說明黃酮類中藥單體被證實具有顯著的抗腫瘤活性，具有誘導凋亡和自噬、抑制增殖和轉移的作用，內在機制可能與多個通路相關，其中就包括PI3K/Akt 途徑。而關于人乳腺癌的研究中，López-Knowles等〔21〕通過實驗證明PI3K通路可以有效抑制腫瘤細胞；Jie等〔22〕則在研究報告中指出，抑制PI3K和Akt的活化可以有效的促進乳腺癌細胞的凋亡。本研究發現EGb-761影響乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡過程，與其他人在不同類型細胞中的研究結果相似，同時，發現EGb-761通過PI3K/Akt途徑調控多種蛋白的表達和活化，作用與MDA-MB-231的生命活動。

綜上，EGb-761通過調控PI3K/Akt途徑扼制MDA-MB-231細胞增殖，誘導其凋亡，具有較好的抗腫瘤作用，其機制可能是通過抑制PI3K及Akt的磷酸化，抑制下游蛋白表達，并誘導MDA-MB-231細胞凋亡。本研究為體外試驗，對EGb-761在生物體內的功效未做探討，能否被機體利用且具體臨床療效，還需要進一步的實驗研究驗證。