促紅細胞生成素衍生肽對表柔比星致大鼠心肌損傷ERK1/2信號通路的影響

馮俊月 李躍榮 馬寶新

(濱州醫學院附屬醫院，山東 濱州 256600)

阿霉素是一種有效的抗腫瘤藥物，但它會導致累積性和劑量依賴性的心臟毒性，范圍從心肌結構和功能的隱匿性改變到可能導致心臟移植或死亡的嚴重心肌病和充血性心力衰竭〔1〕。阿霉素誘導的心臟毒性的確切因果機制仍然不清楚，這使得很難預測或預防其在個別患者中的嚴重不良事件〔2〕。研究發現〔3〕阿霉素和相關的蒽環類藥物表柔比星(EPI)在蛋白和mRNA水平上顯著上調了心肌細胞的死亡受體的表達，由此產生自發凋亡。促紅細胞生成素(EPO)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白激素，具有促進造血的功能，還可作為一種保護因子，作用于機體多種組織器官，包括神經系統、心臟 、腎臟等〔4〕，通過減少細胞凋亡、抑制炎癥反應、促血管生長等發揮其組織保護作用〔5〕。EPO衍生肽(HBSP)是EPO衍生物，HBSP與EPO具有組織保護作用，但HBSP不刺激骨髓造血系統，無促紅細胞生成，避免了EPO導致高血壓、高凝等副作用〔6〕。目前研究表明〔7,8〕，HBSP可能是通過caspase-3凋亡相關蛋白發揮抗凋亡作用，通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路改善EPI所致心肌損傷模型大鼠心肌損傷。細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2是一種與心肌保護相關的重要胞外信號調節蛋白激酶，其相關的信號轉導途徑被認為是經典絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導途徑。然而ERK1/2信號通路是否對EPI所致心肌損傷發揮保護作用需研究證實。本文探討EPO衍生肽對EPI所致大鼠心肌損傷ERK1/2信號通路影響作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料 雄性Wistar大鼠(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)；注射用鹽酸EPI(海正輝瑞制藥有限公司)；注射用重組人促紅細胞生成素(rhEPO) (昂德生物藥業有限公司)；HBSP(上海科肽生物科技有限公司)；細胞色素(Cyt)C、半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)；山羊抗兔多克隆二抗、山羊血清(北京中杉金橋生物技術有限公司)。總RAN提取試劑盒(上海普洛麥格生物產品有限公司)，逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司)；ERK1、ERK2引物及內參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH；上海生工生物工程有限公司)。

1.2動物造模 雄性Wistar大鼠40只，6～8周齡，體重260～300 g，適應性喂養1 w。隨機數字表法分為4組，每組10只，分為正常對照(CON)組、EPI模型組、EPO治療組、HBSP治療組。EPI模型組：每周給與腹腔注射EPI(2.5 mg/kg)1次，共6 w，累積劑量15 mg/kg，注射等量生理鹽水在給與EPI前1 d，后1 d及后3 d；EPO治療組：每周給與腹腔注射rhEPO(5 000 IU/kg)3次，分別為注射EPI前1 d，后1 d及后3 d，共6 w；HBSP治療組：腹腔注射HBSP 60 μg/kg，給藥時間同EPO組。CON組以等量生理鹽水腹腔注射6 w。再喂養5 w后處死大鼠。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色 麻醉大鼠，心臟灌流后，固定取心尖組織，多聚甲醛溶液浸泡固定，經脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋。切片厚約4 μm，行HE染色。于光學顯微鏡下觀察大鼠心臟組織。

1.4免疫組織化學測CytC、caspase-9表達的變化 石蠟塊切片厚約4 μm，常規脫蠟、脫水。乙二胺四乙酸(EDTA)熱修復抗原活性，3%過氧化氫(H2O2)滅活內源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉后滴加一抗，CytC、caspase-9 濃度分別為1∶200、1∶50，4℃孵育過夜。加山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。置于光學顯微鏡下觀察心肌組織，每組隨機取8張切片，每張切片隨機選取5個400倍視野在光鏡下進行觀察。用Image Pro Plus5.1圖像分析軟件測定心肌組織中CytC、caspase-9蛋白表達的平均光密度(IOD/area)，并進行統計分析。

1.5PCR檢測心肌組織中ERK1、ERK 2 mRNA表達 采用RT-PCR法檢測：(1)總RNA 提取：稱取20 mg左右大鼠心肌組織在研磨棒中研磨成勻漿，按總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RAN，取總RNA于紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。(2)逆轉錄：按逆轉錄試劑盒說明書把總RNA逆轉錄成cDNA。(3)以cDNA為模板、以GAPDH為內參，對ERK1、ERK2基因進行擴增。PCR擴增：反應體系為10 μl PCR Master Mix (2×)，10 μmol/L上下游引物。引物序列：ERK1：上游：5′-CCCTTGACCTGAGTGATGAG-3′,下游：5′-CATAGCCCTTCCATTCCAGA-3′;ERK2:上游：5′-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3′,下游：5′-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC-3′;GAPDH:上游：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。cDNA模板2 μl，反應液體積為20 μl。反應條件94℃ 3 min 變性，94℃ 10 s；60℃ 40 s，40循環；72℃ 7 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，使用凝膠成像系統Image Lab進行條帶圖像采集。RT-PCR擴增：反應體系為12.5 μl TB Green，10 μmol/L上下游引物，cDNA模板(<100 ng)2 μl，反應液體積為25 μl。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環；95℃ 10 s。按標準曲線的反應體系及條件進行擴增。分別收集內參GAPDH及目的基因ERK1、ERK2的Ct值，根據 2-ΔΔCt公式計算相對表達量。

1.6統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況 與CON組比較，隨著周齡的增加，EPI模型組大鼠體重增加較少，說明EPI影響了低齡大鼠的生長發育。EPI模型組EPI腹腔注射后，部分開始出現精神萎靡、腹水、脫毛、活動量減少等現象，第9周出現2只大鼠死亡。EPO治療組第10周1只大鼠死亡。第11周時取出兩組心臟稱重并計算心臟重量質量比，結果顯示兩組心臟重量質量比差異無統計學意義(P>0.05)，說明EPI不是通過心肌肥大導致心肌功能損傷。

2.2各組心肌組織病理學結果 心臟組織切片HE染色結果顯示，CON組心肌纖維排列整齊、橫紋清晰，細胞間隙正常，心肌細胞大小、形態正常；EPI模型組心肌細胞腫大、排列紊亂，胞質呈溶解狀態、核深染，橫紋模糊，細胞間隙扭曲增寬，可見部分肌原纖維溶解斷裂。與EPI組比較，EPO治療組及HBSP治療組心肌纖維排列、心肌細胞大小、形態等形態學改變較少。見圖1。

2.3各組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達 各組心肌組織CytC、caspase-9蛋白的陽性表達均為棕黃色顆粒，位于細胞質中。CON組僅有少量CytC、caspase-9蛋白表達。與CON組比較，EPI模型組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達明顯增多(P<0.05)；與EPI模型組比較，EPO治療組與HBSP治療組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。EPO治療組與HBSP治療組之間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、圖3、表1。

圖1 各組心肌組織(HE染色，×400)

圖2 各組心肌組織CytC表達(DAB染色,×400)

圖3 各組心肌caspase-9蛋白表達(DAB染色,×400)

表1 各組心肌組織CytC、caspase-9平均光密度

2.4各組心肌組織中 ERK mRNA表達變化 與CON組比較，EPI模型組心肌組織中ERK1、ERK2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。與EPI模型組比較，EPO治療組和HBSP治療組心肌組織中ERK1、ERK2 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)。EPO治療組與HBSP治療組ERK1、ERK2 mRNA表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表2。

圖4 各組心肌caspase-9蛋白表達(DAB染色,×400)

表2 各組心肌組織ERK1、ERK2 mRNA 相對表達量比較

3 討 論

蔥環類化療藥物，如阿霉素是目前許多腫瘤的重要治療手段之一，但是此類化學藥物容易產生心臟毒性。阿霉素治療引起的急性或長期的心臟毒性受到了臨床極大關注〔9〕。阿霉素誘導的線粒體功能障礙是阿霉素心臟毒性作用的重要機制，進而誘導活性氧增多、心肌細胞凋亡增加和心臟功能下降〔10〕。阿霉素可直接通過線粒體和(或)通過氧化應激和細胞內高鈣來刺激caspase-3誘導的凋亡。增加抗凋亡因子B細胞淋巴瘤(Bcl)-2 的表達和降低促凋亡因子caspase-3和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達可改善阿霉素誘導的心肌細胞凋亡〔11〕。由細胞自發進行的內源性凋亡大部分是以線粒體為中心進行的并由線粒體調節。細胞毒性應激能觸發內源性凋亡途徑，在dATP的作用下，CytC引發凋亡蛋白酶激活因子-1寡聚成大蛋白支架，即凋亡小體，凋亡小體可以激活caspase-9，caspase-9進而激活效應caspase〔12〕，caspase-3能夠裂解一系列的死亡底物，這些死亡底物的裂解會誘導凋亡細胞發生DNA片段化、細胞核碎片化、斷裂細胞膜起泡等一系列細胞表型和生化指標的改變，完成細胞凋亡。

研究發現EPO對多種心臟疾病具有重要的保護作用〔13〕，EPO可緩解氧化應激及炎癥反應，促進血管再生，減少心肌梗死急性期有害物質的釋放，改善心肌重構及心臟舒縮功能，對持續性損傷的心肌細胞具有重要的保護作用〔14〕。EPO需要大劑量才能發揮組織保護作用，會造成對骨髓造血系統的過度刺激〔15〕。螺旋B表面肽(HBSP)是一種新發現的具有組織保護作用的促紅細胞生成素衍生肽，在腎臟〔16〕、肺臟〔17〕及肝臟〔18〕中發揮保護作用。Lin等〔19〕研究發現HBSP保護心肌缺氧/復氧誘導的過度自噬和細胞凋亡。近年來，體內外實驗均證實了HBSP在心臟中的保護作用。HBSP在心肌梗死〔20、21〕、糖尿病心肌病〔22〕及心肌缺血再灌注損傷模型〔23〕中具有抗心肌凋亡及減輕心肌損傷等作用。

由本研究病理學結果可證實EPI誘導的大鼠心肌損傷模型構建成功，實驗結果說明HBSP、EPO改善EPI模型大鼠的心肌損傷。本研究還發現EPI可能是通過線粒體釋放CytC，激活caspase-9通路來促進心肌細胞凋亡，加重心肌損害。而HBSP及EPO可能是降低線粒體釋放凋亡相關因子CytC，抑制caspase-9表達來抑制心肌細胞凋亡，從而發揮心肌保護作用。EPO、HBSP與EPOR-βcR結合后可以激活多種信號通路抑制凋亡、炎癥發揮組織保護作用〔24〕。第一條通路：PI3K/Akt；第二條通路：ERK1/2/MAPK；第三條通路：信號轉導和轉錄激活因子 (STAT)3通路。本研究前期結果顯示，EPO與HBSP通過PI3K/Akt信號通路改善EPI所致心肌損傷模型大鼠心肌損傷。HBSP還可以通過抑制自噬Akt-哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)〔25〕信號通路減輕心肌缺血/再灌注損傷，減輕炎癥因子Akt/糖原合成酶激酶(Gsk)-3β〔26〕信號通路減輕糖尿病心肌病損傷。研究證實在心肌梗死、心肌缺血再灌注及擴張型心肌病動物模型中ERK1/2信號通路參與了心肌損傷保護機制〔27〕。

本研究結果表明，各組均有ERK1、ERK2 mRNA的表達，RT-PCR結果說明HBSP比EPO對ERK1、ERK2基因的表達更具有促進作用。因此，HBSP及EPO改善EPI模型大鼠的心肌損傷可能通過ERK1/2信號通路發揮作用。HBSP改善心肌損傷更強，可能是HBSP通過抑制Akt-mTOR、Akt/Gsk-3β信號通路來進一步減輕心肌損傷，需要實驗證實。由此推論HBSP具有抑制細胞凋亡，保護心肌細胞損傷的作用，其機制可能通過激活ERK1/2信號通路來減少CytC蛋白的表達，降低 caspase-9蛋白的表達，減少CytC釋放，抑制 caspase-9蛋白活性有關。

綜上，ERK1/2的表達與保護心肌損傷關系密切，HBSP對EPI誘導的大鼠心肌損傷模型中ERK1/2基因的表達有干預作用，為化療藥物引起的心肌損傷新藥研究及靶向治療提供新思路。本實驗不足之處，無ERK1/2特異性阻斷劑，無法直接證明ERK1/2信號通路抗心肌細胞損傷，HBSP可能通過多條通路保護心肌，有待后續實驗中進一步研究。