油茶胚性愈傷組織誘導研究

吳紹鑫 全旭林 黎衛東 冉朝輝 付素靜，2 胡玉玲，2

（1銅仁學院農林工程與規劃學院，貴州銅仁 554300；2貴州省梵凈山地區生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州銅仁 554300）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是世界四大木本油料之一，同時也是我國主要的木本油料，具有“東方橄欖油”的美稱，茶油中不飽和脂肪酸含量高達90%，遠遠高于菜油、花生油和豆油，并且含有山茶甙等特定生理活性物質［1］。

油茶在我國有一定的栽培歷史，但是同其他山茶屬植物一樣，其細胞不易誘導分化產生再生植株，造成油茶組織培養的難度較大。油茶幼胚再生體系還不完善，需要利用現代科技進一步研究和優化油茶幼胚再生的培育方法，以提高油茶的栽培成功率，增加油茶的產量和油茶的經濟效益［2］。因此，油茶幼胚再生體系優化是重中之重的問題，可以更好地提高油茶產量，增加油茶產業的可持續發展能力。我國油茶組培再生體系的研究始于20世紀80年代，顏慕勤等［3］認為油茶的愈傷組織起源于單細胞或者多細胞團。隨后隆振雄［4］和盧天玲［5］先后利用油茶未成熟幼胚子葉作為外植體進行再生體系構建，均成功獲得再生植株。在此之后，油茶的再生體系研究進入停滯時期。進入21世紀，油茶組培相關研究和文獻才開始逐漸增多。張智俊等［6］用湘林4號油茶的腋芽和子葉為外植體，成功誘導出愈傷組織并分化成完整植株。畢方誠等［7］用莖段、幼胚及子葉為外植體進行離體培養，獲得了再生植株。

本研究針對油茶幼胚再生體系不完善的問題，期望從中找出適合于愈傷組織誘導的培養基種類，以提高油茶幼胚再生效率，獲取更多的易再生油茶基因型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料采集及處理

1.1.1 外植體的采集和儲存 采集點位于銅仁市松桃縣正大鄉，采取7—8月快速生長期［8］的不同油茶樹的果實為試驗材料。對不同品種的油茶果實進行編號，分別于7月15日和8月5日進行采樣，選擇健康、外觀大小一致的茶果，且在晴天的上午采摘，降低污染率。將采回的油茶果實放入4 ℃冰箱保存，適合的低溫有利于促進細胞的分裂。

1.1.2 無菌體系的建立 把試驗用的油茶果用解剖刀剝開油茶外果皮，小心取出里面的種子，按編號放入瓶中流水沖洗30 min以上，轉入超凈工作臺用75%的酒精消毒30 s，無菌水清洗4～5次，再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，再用無菌水清洗4～5次，在消毒與清洗的過程中，不停搖晃，使外植體表面和消毒液、無菌水充分接觸，以提高消毒效率，盡量降低消毒液對材料的毒害作用。在無菌操作臺上使用鑷子和解剖刀小心地去除種皮，把油茶幼胚等分切成2～4份，接種到無菌培養基中。每瓶培養基接種一個外植體，每處理接種15瓶，每處理重復3次，觀察記錄外植體存活情況以及愈傷組織誘導狀況。

1.1.3 愈傷組織誘導 把經過滅菌后的外植體接種到添加了不同濃度的NAA、6-BA、KT、TDZ的MS、WPM培養基中，并添加0.5 g/L的活性炭降低外植體組培褐化率，培養基pH為5.8，使用不同水平的正交試驗設計，見表1。

表1 L16（81+28）正交

續表1 L16（81+28）正交

1.2 培養環境在培養室進行油茶幼胚組培苗無菌體系建立，接種后將其放置于培養溫度為（25±2）℃，光照強度為1 500 lx的日光燈下，光照時間為12 h/d。

1.3 數據處理與統計分析計算外植體的存活率和愈傷組織誘導率，公式如下：

存活率（%）=（接種外植體總數－外植體褐化個數）/接種外植體總數×100；

誘導率（%）=誘導出愈傷組織的外植體個數/接種外植體總數×100；

胚性愈傷組織誘導率（%）=胚性愈傷組織塊數/接種外植體數×100

使用Microsoft Excel 2016 軟件進行數據整理、統計和做圖等，用SPSS 25.0 統計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 各因素對愈傷組織誘導的影響從表2可以看出，各因素中對愈傷組織的誘導影響最顯著的為品種>培養基>NAA>TDZ，其他的因子對愈傷組織的誘導沒有顯著性影響。不同品種對愈傷組織的誘導率為小型茶果>大果品種1>晚熟品種1>大果品種3>大果品種2>早熟品種2>早熟品種1>晚熟品種2。不同基本培養基對愈傷組織誘導率為MS>WPM。添加了1.0 mg/L的NAA培養基對愈傷組織的誘導率有顯著影響。從愈傷組織的誘導率來看，油茶幼胚最適的愈傷組織誘導培養基為2號和15號培養基，其配方分別為：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ和MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ，愈傷組織誘導率均達到100%，其中2號培養基中愈傷組織有膨大凸起，鑒定為胚性愈傷組織，且體積增大效果最好。

表2 不同培養基和植物激素對油茶幼胚愈傷組織誘導的影響

2.2 不同因素間互作效益對愈傷組織誘導的影響由表3可以看出，NAA與KT和6-BA與TDZ之間的互作效益對愈傷組織的誘導具有顯著性的效果（P<0.05），而其他因子之間的互作效益對愈傷組織的誘導不具有顯著性的效果（P>0.05）。

表3 不同因素間互作效益

2.3 多因素間互作效益對愈傷組織誘導的影響由表4可以看出，不同多因素組合的互作效益對愈傷組織的影響效果不同，6-BA與KT與TDZ之間的多因素互作效益對愈傷組織的誘導具有極顯著性的效果（P<0.01），但是其他多因素之間的互作效益對愈傷組織的誘導不具有顯著性的效果（P>0.05）。而6-BA與KT與TDZ之間的多因素互作效益不止能極顯著的誘導萌發成愈傷組織，還能明顯增加愈傷組織的發育速度。如圖1、2所示，2號培養基的胚性愈傷組織體積明顯高于其他處理的愈傷組織體積。

表4 多因素間互作效益

圖1 2號培養基中的胚性愈傷組織

圖2 1號培養基中的愈傷組織

3 小結與討論

本研究以銅仁市松桃縣正大鄉7—8月快速生長期普通油茶幼胚為外植體，研究了不同品種、不同發育時期、不同培養基、不同激素種類及濃度、不同培養條件等6個因素的不同水平組合對于胚性愈傷組織誘導的影響，對油茶幼胚再生體系進行優化探索。

油茶是喜酸性土壤的植物，但是對于組培來說，培養基酸性的程度并不影響油茶幼胚在不同pH的培養基中對愈傷組織誘導情況，有研究認為隨著pH上升，胚性愈傷組織誘導率略有增加，但影響不顯著，對愈傷組織類型也不影響［9］。因此，本研究培養基的pH為5.8。

單因素中愈傷組織的誘導影響為品種＞培養基＞NAA＞TDZ，其他的因子對愈傷組織的誘導沒有顯著性影響，但是不同激素種類對愈傷組織的誘導具有顯著性差異，其中最佳的為6-BA+KT+TDZ，因此油茶胚性愈傷組織誘導配方為：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ，胚性愈傷組織誘導率達到100%，體積增大效果最好。

對于本試驗來說，基本培養基為MS時，愈傷組織誘導率為89.13%，基本培養基為WPM時，愈傷組織誘導率僅為57.13%，說明MS基本培養基更適于油茶愈傷組織的誘導。但在油茶幼胚的誘導中，胡玉玲等［9］認為MS更為適合，賈效成等［10］認為WPM作為基本培養基最適合，可以看出油茶幼胚誘導成愈傷組織的最適培養基還未明確，也可能與不同的激素種類及濃度的互作效益有關，因此還需要進一步探索。