正交設計優化茅蒼術組培苗生根及增殖的研究

王晨瑤 劉夢蝶 崔鑫奇 李萌華 管志昊 信龍飛 劉紅云

（信陽農林學院農學院，河南信陽 464000）

蒼術為多年生草本植物，其干燥根莖是著名的傳統藥材。2015年出版的《中國藥典》中記載，茅蒼術味微甘、辛、苦，北蒼術味辛、苦。茅蒼術主要用于治療脘腹脹滿、水腫、腳氣痿蹙、風濕痹痛、風寒感冒、雀目夜盲等［1］。由于自身特性及人為因素，蒼術的分布區域和種群數量均有明顯的衰退［2］。在所有常用大宗中藥資源品種中，蒼術為11種瀕危稀缺藥材物種之一，被列為省二級珍稀保護植物［3］。近年來，隨著對蒼術的綜合開發，蒼術的用途擴大，除藥用外還可用作各種飲料的添加劑和加工工藝品香包等用途［4］。

隨著蒼術野生品不斷遭到破壞，以提高蒼術根莖的質量為標準，在原有的技術上培育出有價值的茅蒼術資源迫在眉睫。但人工繁殖的茅蒼術成本高且成活率較低，因此茅蒼術組織快繁體系的建立非常有必要。藥用植物的組織培養主要著重于以下4個方面：植株培養、成分比較、植物生理研究及工業化生產的探究［5］。根據馬輝［6］等在研究藥用植物白術中的方法，確定正交實驗設計可以大大簡化試驗結果，節約試驗經費和時間，具有工作量小、信息量大、數據分析簡單并可分析交互作用等優點。2009年，邱璐等在菊花培育中也通過正交試驗優化了菊花的組織培養條件［7］。采用正交設計法可以用最少的處理組合數研究較多的試驗因素，以達到精簡試驗次數結果。通過分析試驗結果選擇最佳的培養條件，以揭示各因素對培養效果作用的相對大小［8］。筆者基于前人的研究培育出優質的茅蒼術種苗，可減少人工成本，得到高效優質并適合大面積種植的蒼術苗，為茅蒼術產業的優質化、標準化、規模化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料及原材料處理選用河南省信陽市平橋區顧崗水庫一帶的茅蒼術成熟種子。參考劉海萍等［9］的方法，將茅蒼術種子置于1 000 mL燒杯中，流水下沖洗30 min，再于純凈水中靜置5 min。將漂浮于水面的干癟種子除去，經過濾保留底層飽滿充實種子，用網布包好，在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min左右，清水洗凈后放入超凈工作臺內。接種前用75%乙醇消毒30 s后用0.1%氯化汞消毒15 min，無菌水沖洗4～5次，每次不少于3 min。然后將種子接種于MS培養基內，培養過程中統計種子萌發率及污染率。

1.2 方法

1.2.1 生根培養 將2 cm左右的外植體接種在生根培養基內，培養條件同繼代增值培養，3～5 d開始長根，8～10 d基本產生1～3 cm的根，45 d后生根率達100%，隨機選取14瓶進行分析。

1.2.2 增殖培養 用初代培養的根莖作為外植體，每瓶接種1個外植體，外植體約2 cm，每組培養基接種28瓶。培養45 d后隨機取14瓶進行分析。將原材料轉接于不同含量的生根或繼代培養基內，培養基用7 g/L的瓊脂固化，蔗糖為30 g/L，pH值5.8～6.0。培養條件為光照強度1 000～1 500 lx，置于（22±2）℃溫度下培養，光周期（16 L∶8 D）。

1.3 單因素試驗在MS培養基的基礎上，分別改變NAA、6-BA、糖、活性炭4個因素，并設計4個水平（表1），隨機組合成20個不同的處理，考察茅蒼術組培苗的生長水平，以得出不同濃度的培養基組合對茅蒼術生長的影響。

表1 茅蒼術快速繁殖因素及水平

1.4 正交優化設計

1.4.1 正交優化茅蒼術生根 依據劉英翠等［10］在提取沙棘葉總黃酮中的試驗方法，根據上述單因素試驗的結果，全面考察不同培養基的類型和3種不同植物生長調節劑對茅蒼術生根誘導的影響，以生根率確定最適宜的培養基配比，設計L9（34）正交試驗（表2）。

表2 茅蒼術生根誘導正交試驗因素水平

將培養的壯苗轉移到培養基內，誘導生根。參考左靜靜等［11］的結果處理，45 d后統計生根數、生根率及生長情況，如圖1所示。

圖1 不同因素對茅蒼術生根的效果

生根誘導率（%）=生根的組培苗數/接種的總組培苗數×100

1.4.2 正交優化茅蒼術增殖 選用常用的生長素NAA和細胞分裂素6-BA作為培養基中的植物生長調節劑，設計了L9（34）正交試驗，考察NAA和6-BA 2種植物生長調節劑、基本培養基成分對增殖誘導的影響［12］，如圖2所示。試驗設計見表3。

圖2 不同因素對茅蒼術生根的效果

表3 茅蒼術增殖誘導正交試驗因素水平

增殖誘導率（%）=增殖的不定芽數/接種的總組培苗數×100

2 結果與分析

2.1 單因素結果分析將培育的壯苗轉接于以MS培養基為基礎培養基，設計NAA濃度為0.1、0.2、0.5、0.3 mg/L的培養基內進行生根誘導。45 d后，以根長、根粗和根的生長狀況為考察對象進行統計分析［13］。結果顯示，NAA的濃度不同，根系生長有一定的差異。由表4可知，NAA濃度為0.5 mg/L時，根較粗長且分根數較多，根生長的最好。當NAA濃度為0.1 mg/L時，根細且短，生長較差。故適宜茅蒼術生長的NAA濃度培養基應為MS+NAA 0.5 mg/L。

表4 不同濃度NAA對茅蒼術生根誘導的影響

與生根方法相同，將茅蒼術壯苗轉接于以MS為基礎培養基的培養基內，設計6-BA濃度為1.0、1.5、2.0、0.5 mg/L的培養基內進行增殖誘導。觀察45 d后取樣，以平均葉數、平均株高和分枝數作為考察目標進行分析。通過SPSS軟件進行分析可知組間F=6.98，其P=0.013<0.05，表明組間株高差異顯著。如表5所示，6-BA濃度為1.5 mg/L時，植株健壯且分枝較多。因此，6-BA濃度為1.5 mg/L時，對茅蒼術增殖效果較好。

表5 不同濃度6-BA對茅蒼術增殖誘導的影響

在單因素分析的基礎上，確定在后續的正交設計中NAA的濃度為0.1、0.2、0.5 mg/L、3個水平進行誘導茅蒼術生根的優化，6-BA選擇1.0、1.5、2.0 mg/L 3個水平對茅蒼術進行增殖優化。

2.2 正交優化茅蒼術生根的結果分析采用L9（34）正交試驗設計，以培養基、NAA、糖、6-BA為考察因素，每個因素設計3個不同的水平，進行不同的組合。基礎培養基分別為MS、1/2MS、1/4MS，6-BA 1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA分別為0.1、0.2、0.5 mg/L，糖分別為15、30、45 g/L，取茅蒼術單芽接種到各培養基中，每瓶一芽，一組14瓶，45 d后統計數據。使用Excel、SPSS正交分析數據，篩選出最適宜茅蒼術叢生芽生根及增殖的培養基組合，分析不同培養基對茅蒼術叢生芽的影響。

將生長健壯的叢生芽接種至9組不同的培養基組合內，進行生根培養。7 d后第4、5、6組開始萌動生根，14 d后各組均長出根。第4組中長出的根粗且長，第9組在接種10 d后才開始萌動生根，且細、短［11］。由表6可知，由于各組水平不同，各組生根情況存在明顯的差異，第2組生根較多，且根粗、長，生根率為32.1%。由此可知，茅蒼術的最適生根培養基為MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L糖+1%活性炭。

表6 正交優化對茅蒼術生根的影響

2.3 正交優化茅蒼術增殖的結果分析接種后，對叢生芽的增殖情況進行觀察，結果顯示，在接種10 d后，第6組幼芽開始萌動，12 d后，各組均開始萌動。45 d后統計叢生芽增殖率。由表7可知，不同的外源激素配比對叢生芽誘導的效果不同，并存在明顯差異。第1、2、5、7、8組，叢生芽長勢一般，在長勢一般的5組試驗中，第1組叢生芽的增殖率最小，第3、4、6、9組叢生芽長勢良好。在長勢良好的4組試驗中，第4組叢生芽的增殖率最大。因此，最適宜茅蒼術增殖的培養基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1.0 mg/L 6-BA。

表7 正交優化對茅蒼術增殖的影響

續表7 正交優化對茅蒼術增殖的影響

3 討論

該試驗中，單因素分析為茅蒼術正交優化設計提供了一組數據，為茅蒼術的無性繁殖提供了一種方法，有助于短期內提供大量的試管苗，通過人工栽培擴大資源，確保茅蒼術資源的保護和可持續利用。該試驗結果表明，在茅蒼術的組織培養中，應用正交設計法可以通過減少試驗次數，有效地篩選出最佳方案。

本試驗表明，茅蒼術最適生根培養基為MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1%活性炭，生根數最多且根較粗，生根率可達32.1%，試驗結果與李文等［13］的研究結果不一致，原因可能是與前人試驗中添加激素種類與濃度不同。不同的培養基組合均可誘導茅蒼術生根。在該試驗中，生根誘導不局限于NAA的作用，也受6-BA、糖等的促進，同時培養基內添加的活性炭也對茅蒼術生根有一定的影響。

茅蒼術的最適增殖培養基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1.0 mg/L 6-BA，增殖率可達28.6%。過高或過低濃度的6-BA及NAA對茅蒼術叢生芽的增殖率均有一定的影響。這與李西騰等［1］的研究相比，在培養過程中添加激素的種類和濃度對叢生芽的增殖效果產生了不同的影響。

在茅蒼術的快速繁殖過程中，以根莖作為外植體進行培養已經建立比較完整的無性繁殖體系，然而近年來高品質的茅蒼術品種不易培育［14］。因此，在今后的進一步的研究中，要將茅蒼術生長發育所需的營養、新陳代謝規律、適宜的生態環境等結合起來，通過生物技術進行茅蒼術優良品質的選育和提純復壯，保護種質資源，實現茅蒼術優良植株或種子的規模化生產［15］。