四川牦牛UCP1基因遺傳多態性及其與肉品質性狀的關聯分析

陸惠嫻，于海濱，謝 濤，阮夢茹，Ambreen Iqal，姜 平，趙志輝

(廣東海洋大學 濱海農業學院,廣東 湛江 524088)

牦牛(Bosgrunniens，yak)主要分布于我國海拔3 000～5 000 m的青藏高原及其毗鄰高山、亞高山地區，是高原地區特有的、耐粗飼、抗寒性能強和適應低氧環境的物種資源之一，受到當地牧民的長期馴養，是一種乳肉役兼用型品種。高原地區的低氧環境使得牦牛機體中糖酵解反應、酶活性及載氧能力增強等生理生化反應發生適應性的變化[1-4]，并影響著牦牛屠宰后的肉質特性的改變。肉品質主要包括營養品質、食用品質和加工品質三方面，評價營養品質的指標包括各種營養物質的含量，如脂肪酸含量、蛋白含量、氨基酸含量等；評價食用品質和加工品質的指標包括肉色、pH值、系水力、風味物質含量和嫩度等[5]。

解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)是解偶聯蛋白家族中的一員，是棕色和米色脂肪細胞特異性表達一種產熱線粒體蛋白，其可以通過驅散電子傳遞鏈產生的電化學梯度，將底物氧化與ATP合成分離，從而導致熱量釋放，是在寒冷條件下維持體溫或在哺乳動物(包括人類)攝入過多熱量時維持能量穩態的機制中的關鍵因素[6-8]。目前大多數關于UCP1基因功能的研究主要集中在人和小鼠脂肪代謝、能量代謝和糖尿病方面[9-11]，而且本課題組前期組學分析發現：UCP1基因可能對脂質代謝具有重要調控作用，對肉牛肉品質性狀可能具有重要的影響。有研究表明UCP1在牦牛心臟、肝臟、脾臟等各個組織中均有表達，但在腎臟組織中的表達量顯著高于其他組織，并且UCP1基因在麥洼牦牛背最長肌以及肝臟中的表達量顯著高于金川牦牛[12]。羅剛等[13]研究表明牛UCP1基因編碼區存在5個錯義突變多態性位點與牛抗寒性狀存在顯著相關性。安清明等[14]研究表明UCP1基因對綿羊的生長發育性狀影響具有性別特異性，且攜帶等位基因A1的公羔群體具有較低的胴體性狀。

因此，本試驗初步探討UCP1基因的遺傳多態性與四川牦牛肉品質性狀的相關關系，采用直接測序的方法驗證UCP1基因的相關分子標記，為挖掘相關遺傳標記為改善牦牛肉品質的標記輔助選擇提供理論依據，為進一步闡明UCP1基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物牦牛來自四川省阿壩州某牛場，采集了103頭健康牦牛血液樣品于-20℃保存，用于提取血液基因組DNA。

1.2 主要試劑全基因組血液DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購自博格林生物有限公司；Taq PCR Mix、1×TAE電泳緩沖液均購自諾維贊公司。

1.3 血液基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取血液DNA，步驟參照試劑盒說明書，使用NanoDropTMLite Spectrophotometer儀器檢測DNA濃度和純度，-20℃保存備用。

1.4 引物設計根據NCBI數據庫提供的UCP1基因組序列(編號：ENSBMUG00000011219.1)，使用Primer 5.0軟件進行UCP1基因的引物設計，上游引物：5′- TGGTAAAGAATCTGCCTGCG-3′；下游引物：5′-TCTCCATCCCAAGCTGAATC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

1.5 目的基因PCR擴增及驗證PCR反應體系(20 μL)：2×Green Taq Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2 結果

2.1UCP1基因PCR擴增產物驗證PCR擴增獲得的四川牦牛UCP1基因產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，PCR產物擴增特異性良好，無雜帶，條帶清晰(圖1)，可直接用于測序鑒定。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.分別為不同個體的PCR擴增產物

2.2 測序結果UCP1基因的內含子4和外顯子5中發現了4處SNPs位點，分別為I4-769 G>A、I4-836 C>T、E5-26 C>G和E5-59 A>G。4個SNPs的每種基因型測序結果如圖2～5所示。

Ⅰ.基因型為GG的個體；Ⅱ.基因型為GA的個體;Ⅲ.基因型為AA的個體

Ⅰ.基因型為CC的個體；Ⅱ.基因型為CT的個體；Ⅲ.基因型為TT的個體

Ⅰ.基因型為CC的個體；Ⅱ.基因型為CG的個體；Ⅲ.基因型為GG的個體

Ⅰ.基因型為GA的個體；Ⅱ.基因型為AA的個體

表1 UCP1基因4個SNPs的群體遺傳特性

2.4UCP1基因4個SNPs位點的不同基因型與四川牦牛肉品質的相關性分析使用SPSS 22.0單因素方差分析UCP1基因SNPs與牦牛肉品質的相關性，結果如表2所示，I4-769 G>A位點的AA型的背最長肌紅度(a*)顯著高于GG型；在I4-836 C>T位點中CC型的背最長肌紅度(a*)和黃度(b*)相對CT型顯著升高(P<0.05)；E5-26 C>G位點的CC型的背最長肌亮度(L*)顯著低于CG型(P<0.05)，而CC型背最長肌紅度(a*)和黃度(b*)顯著高于CG型(P<0.05)；E5-59 A>G位點的GA型的背最長肌24 h時的pH值顯著高于AA型(P<0.05)。

結果表明，除E5-59 A>G位點外，其余SNPs位點均與牦牛背最長肌的肉色顯著相關，推測其余3個SNPs位點能作為牦牛背最長肌肉色的分子標記位點；E5-59 A>G位點與牦牛背最長肌2 h時的pH值顯著相關，說明這個SNP可能是牦牛宰后pH值的分子標記位點，對肉質性狀具有重要指導作用。

表2 UCP1基因4個SNPs不同基因型與牦牛肉品質的相關性分析結果

2.5UCP1基因不同單倍型組合與四川牦牛肉品質的關聯分析使用Haploview 4.2軟件對4個SNPs位點進行連鎖分析，結果顯示，I4-769 G>A、I4-836 C>T和E5-26 C>G這3個位點存在強連鎖遺傳，3個位點構成了一個結構域，共有6種不同的單倍型組合(圖6，表3)。

LSD法分析6種單倍型組合與四川牦牛肉品質的關聯性，結果如表3所示，H1H1和H1H2單倍型組合的背最長肌亮度(L*)顯著低于H1H3單倍型組合(P<0.05)；H2H2單倍型組合的背最長肌紅度(a*)和黃度(b*)顯著高于H1H3單倍型組合(P<0.05)；而H2H2單倍型組合的背最長肌黃度(b*)顯著高于H1H3和H2H3單倍型組合(P<0.05)。

圖6 UCP1基因的牦牛群體SNPs位點連鎖反應

表3 UCP1基因單倍型與牦牛肉品質的相關性分析結果

3 討論

3.1 四川牦牛UCP1基因的遺傳多態性綜合評價群體遺傳多樣性的重要參數有遺傳雜合度、等位基因數和多態信息含量等信息，是育種工作中的重要參考數據和指標[15]。3個參數均能衡量群體發生遺傳變異的程度，較理想的雜合度為0.50～0.70；PIC分為高度多態基因座(PIC>0.50)、中度多態基因座(0.25A、I4-836 C>T和E5-26 C>G位點的基因雜合度和多態信息含量均處在0.25～0.50范圍內，表明這3個SNPs在群體多態性中屬于中度多態性；而E5-59 A>G位點的基因雜合度和多態信息含量均小于0.25，表明該位點在群體多態性中屬于低度多態性，說明該群體具有一定的遺傳選擇潛力[14]。E5-26 C>G和E5-59 A>G位點的突變發生在外顯子上，E5-26 C>G位點由編碼絲氨酸的TCC突變成TCG和E5-59 A>G位點由編碼亮氨酸的CTA突變成CTG，雖然2個位點的突變屬于同義突變，密碼子的簡并性不會影響蛋白質分子的結構和功能，但同義密碼子的使用模式存在一種密碼子偏好性，即在蛋白質合成過程中基因編碼同種氨基酸的幾種同義密碼子會被傾向其中的一種或幾種的現象，這種偏好性被應用在提高特定蛋白質表達量、基因分類和基因功能預測以及研究蛋白質結構和功能方面[19]。宋喬喬[20]研究表明牦牛的密碼子以G或C結尾的密碼子偏好性更高，則提示E5-26 C>G和E5-59 A>G位點更偏好突變后的密碼子。4個SNPs在牦牛群體中均處于哈代溫伯格平衡，這可能是群體中個體間隨機交配，沒有新基因加入，沒有發生遷移和遺傳漂移，人工選擇強度小。

3.2UCP1基因4個SNPs位點不同基因型與四川牦牛肉品質的相關性肉色是消費者視覺上的第一感官，能直接影響消費者的消費行為。而且肉色與肌肉中肌紅蛋白含量、肌紅蛋白氧化程度及高鐵肌紅蛋白含量有關，剛屠宰后肌肉中還含有大量還原型肌紅蛋白，隨著時間的增長，肌紅蛋白會被空氣中的氧氣氧化，肉色會由鮮紅色逐漸變成褐色[21]。評定肉色主要包括紅度(a*)、黃度(b*)和亮度(L*)。L*的數值范圍為0 (全黑) 到100 (全白)，數值越大代表肉色越亮，肌內脂肪含量越高；a*的數值范圍為從+127(洋紅色)到-128(綠色)，數值越大則代表肉色越紅；b*數值范圍為+127(黃色)到-128(藍色)，肉類加工過程中黃度的變化會影響消費者的感官[22-24]。一般來說，在一定范圍內，a*值越大，L*和b*越小，代表肌肉的顏色就越鮮紅，說明肌肉品質就越好；a*值太大而L*值太小就會形成黑干肉；反之，L*值太大而a*值太小就會形成白肌肉[25-26]。本試驗發現的I4-769 G>A位點的AA型、I4-836 C>T位點的CC型和E5-26 C>G位點的CC型的a*均最高，b*也高，L*卻最低，這提示I4-769 G>A位點的AA型、I4-836 C>T位點中CC型和E5-26 C>G位點的CC型可作為改善牦牛肉色的最優基因型，為牦牛改善肉品質提供理論基礎。而E5-59 A>G位點的GA型的背最長肌宰后24 h時的pH值顯著高于AA型，且GA型肉色指標(a*、b*和L*)均高于AA型，由于屠宰后pH值的變化與肌肉中發生的糖酵解反應有關，隨著時間的增長，糖酵解產生的乳酸越多，肉的pH值會從屠宰后的pH 6～7下降至極限值pH 5.4～5.6[27-28]，而且肌肉中的乳酸鹽還會加快肌紅蛋白的還原，提高肉色的穩定性[29]，因此，提示E5-59 A>G位點的GA型可作為提高牦牛宰后pH值的最優基因型，為選育優質肉品質品種的牦牛提供分子遺傳標記。

3.3UCP1基因不同單倍型組合與牦牛肉品質性狀的相關性基于單核苷酸多態性(SNP)分析只能發現保守和非保守分子功能有關的基因，而不能識別相互作用的等位基因連鎖遺傳，人們提出了另一種選擇目標的方法——基于考慮到群體結構和個體間差異性關聯的連鎖不平衡(LD)[30-32]。因此，本試驗發現I4-769 G>A、I4-836 C>T和E5-26 C>G這3個位點存在強連鎖遺傳，其中H1H1和H1H2單倍型組合的背最長肌亮度(L*)顯著低于H1H3單倍型組合，H2H2單倍型組合的背最長肌紅度(a*)和黃度(b*)顯著高于H1H3單倍型組合，而且H2H2單倍型組合的背最長肌黃度(b*)顯著高于H1H3和H2H3單倍型組合。結合UCP1基因的單個SNPs位點的分析結果可推測H2H2單倍型組合可作為改善牦牛肉色的最優單倍型組合，為提高牦牛選種選育效率提供一定的參考。

綜上所述，本研究發現牦牛UCP1基因的內含子4和外顯子5共存在I4-769 G>A、I4-836 C>T、E5-26 C>G和E5-59 A>G共4個SNPs位點。I4-769 G>A位點的AA型、I4-836 C>T位點的CC型和E5-26 C>G位點的CC型可作為改善牦牛肉色的最優基因型；E5-59 A>G位點的GA型可作為提高牦牛宰后pH值的最優基因型；H2H2單倍型組合可作為改善牦牛肉色的最優單倍型組合。本研究為牦牛改善肉品質標記輔助育種及建立優勢優質群體提供了理論依據。