無針肌內(nèi)注射免疫四價流感裂解疫苗的免疫保護效果評價

史伯昌，田崇瑜，許振國，譚凌云，李欣昱，李華斌，賀 威，劉 媛，閆 芳，鄭源強，趙忠鵬*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010058；2.山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 晉中 030800；3.長春海基亞生物技術(shù)股份有限公司，吉林 長春 130507；4.吉林省銀諾克藥業(yè)有限公司，吉林 長春 130000；5.安徽醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，安徽 合肥 230032)

2021年2月26日，世界衛(wèi)生組織(WHO)表示，未來有可能流感疫情大暴發(fā)，根據(jù)CDC各成員國每周報告的流感病例統(tǒng)計和WHO下屬機構(gòu)National Influenza Centers (NICS)和 WHO Collaborating Centers(CCs)搜集的數(shù)據(jù)，快速發(fā)布了北半球季節(jié)性流感疫苗毒株。目前已知流感病毒和新冠病毒共感染會加重患者的病情[1]，隨著新冠肺炎疫情發(fā)展，其病毒變異株不斷出現(xiàn)，目前出現(xiàn)的奧密克戎變異株，較疫情初期出現(xiàn)的毒株傳播力更強，流感疫苗和新冠疫苗接種工作迎來新的挑戰(zhàn)[2]，要求短期內(nèi)必須完成大規(guī)模人群的快速接種。無針連續(xù)注射免疫方便快捷，有利于快速實施大規(guī)模人群的疫苗接種，同時又可以解決針頭恐懼癥和避免針刺傷的風險，是替代傳統(tǒng)有針注射免疫的有效方法[3-5]。為推進流感疫苗和新冠疫苗的快速接種工作，為無針注射疫苗進入臨床試驗做準備，本研究在已有四價流感病毒裂解疫苗(有針肌內(nèi)注射)基礎(chǔ)上，對四價流感病毒裂解疫苗(無針肌內(nèi)注射)品種進行了臨床前試驗，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 無針注射免疫裝置及疫苗低壓無針注射器(型號MIT-H-IV)和一次性注射頭，購自江蘇丞宇米特醫(yī)療科技有限公司。四價流感病毒裂解疫苗，每劑各含15 μg 血凝素的A/California/7/2009(H1N1)、A/Switzerland/9715293/2013(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(Bv)、B/Phuket/3073/2013(By)裂解抗原，由長春海基亞生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 實驗動物SPF級SD大鼠，250～300 g，每組6只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心清潔級動物房；巴馬小型豬，25 kg，普通級，每組3只，購自中國科學院動物研究所，飼養(yǎng)于北京通和立泰生物科技有限公司清潔級動物房；10日齡SPF雞胚購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 體外評價用野生毒株及受體破壞酶(RDE)液野生毒株由軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所提供；RDE液由中國CDC國家流感中心提供。

1.4 動物免疫程序?qū)D大鼠和巴馬小型豬隨機分組。分別以7.5，15，30 μg HA抗原量，陰性對照組以等量PBS，注射于后肢肌肉，無針肌內(nèi)注射按照無針注射器使用說明操作，有針肌內(nèi)注射常規(guī)操作；免疫2次，間隔21 d。每次免疫后21 d采血并分離血清。

1.5 血凝抑制試驗測定血清血凝抑制(HI)效價按1∶4比例將待測動物血清與RDE混合，37℃孵育18 h以消除非特異凝集抑制因子，然后56℃ 50 min滅活RDE。將處理后的待測樣品與PBS 1∶1混合，倍比稀釋后加入50 μL 含4 HAU的滅活病毒，室溫孵育1 h。孵育后每孔加入50 μL 1% 雞紅細胞，混勻，室溫靜止30 min。以能完全抑制紅細胞凝集的最高血清稀釋度的倒數(shù)乘以5為血清HI效價。

1.6 雞胚中和試驗測定血清中和(NA)效價將各型別野生病毒懸液以10倍倍比(10-9～10-1)稀釋，每稀釋度接種4枚雞胚，0.2 mL/枚，33～35℃孵育72 h，根據(jù)血凝試驗判定結(jié)果，應(yīng)用Reed-Meunch公式進行計算EID50。將免疫各組血清混合后，做1∶80～1∶5 120倍倍比稀釋，56℃滅活30 min；滅活后各組血清與相應(yīng)的100 EID50病毒等量混合，置室溫中和1 h；中和后立即接種10日齡雞胚，每稀釋度接種4枚雞胚，每只0.2 mL，35℃培養(yǎng)72 h；冷胚，做直接血凝，按Reed-Meunch法計算抗體中和效價。

1.7 統(tǒng)計學分析使用 Graphpad Prism 9.0進行數(shù)據(jù)分析，組間抗體滴度比較采用雙側(cè)t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 四價流感病毒裂解疫苗(無針注射)接種位置的確定結(jié)果顯示，無針注射器在60～100 PSI個氣壓時，SD大鼠后肢的皮膚出現(xiàn)明顯皮丘，皮丘部位皮膚變薄，發(fā)亮，有輕微出血；在100～120 PSI個氣壓時，大鼠的皮膚注射液體貯留，且無注射液體溢出、注射部位輕微隆起；無針注射器高于120 PSI個氣壓時無注射液體溢出，注射部位皮膚無皮丘，但注射部位有少量出血(圖1A～C)。巴馬小型豬在不同氣壓下出現(xiàn)了相似的情況。因此，無針注射器在100～120 PSI個氣壓時，SD大鼠無針肌內(nèi)注射的部位最為準確。無針注射器在200～240 PSI個氣壓時，巴馬小型豬無針肌內(nèi)注射的部位最為準確(圖1D～F)。

A～C.在不同的壓力水平下，無針肌內(nèi)注射SD大鼠后肢肌肉接種四價季節(jié)性流感疫苗后注射部位的情況; D～F. 在不同的壓力水平下，無針肌內(nèi)注射巴馬小型豬后肢肌肉接種四價季節(jié)性流感疫苗后注射部位的情況

2.2 無針肌內(nèi)注射疫苗免疫原性試驗各劑量組無針肌內(nèi)免疫SD大鼠血清后檢測HI效價，結(jié)果表明四價流感病毒裂解疫苗免疫SD大鼠后能刺激機體產(chǎn)生較好的抗體效價，二次免疫后抗體水平逐漸提高，而且疫苗的免疫劑量在一定范圍內(nèi)與刺激機體產(chǎn)生的抗體水平呈正相關(guān)(圖2A，B)。各劑量無針肌內(nèi)免疫巴馬小型豬，其HI抗體效價表現(xiàn)出與SD大鼠相似的趨勢。結(jié)果表明，無針肌內(nèi)免疫可完全替代有針肌內(nèi)免疫接種四價季節(jié)性流感疫苗(圖2C，D)。

A，B.第1,2次無針肌內(nèi)注射SD大鼠四價季節(jié)性流感疫苗后21 d的HI抗體效價;C，D.第1,2次無針肌內(nèi)注射巴馬小型豬四價季節(jié)性流感疫苗后21 d的HI抗體效價

2.3 無針肌內(nèi)注射與有針肌內(nèi)注射途徑的免疫效果比較各劑量組無針肌內(nèi)注射及有針肌內(nèi)注射免疫SD大鼠后檢測血清HI抗體效價，結(jié)果表明在7.5,15,30 μg HA抗原量時無針肌內(nèi)注射及有針肌內(nèi)注射免疫效果相當(圖3)。

圖3 無針肌內(nèi)注射與有針肌內(nèi)注射的免疫效果比較

2.4 四價流感病毒裂解疫苗(無針注射)中和抗體效價結(jié)果顯示，隨接種劑量升高，SD大鼠血清中和抗體效價升高，且2次免疫后保護性中和抗體水平進一步提高(圖4A，B)；巴馬小型豬無針肌內(nèi)免疫產(chǎn)生保護性抗體與SD大鼠趨勢一致(圖4C，D)。因此，SD大鼠及巴馬小型豬無針肌內(nèi)注射免疫后產(chǎn)生的抗體均具有良好的免疫保護性。

A，B.第1，2次無針肌內(nèi)注射SD大鼠四價季節(jié)性流感疫苗后21 d的NA效價;C，D.第1，2次無針肌內(nèi)注射巴馬小型豬四價季節(jié)性流感疫苗后21 d的NA效價

3 討論

在當前呼吸道傳染病肆虐的大背景下，全世界疫苗接種工作迎來重大挑戰(zhàn)。根據(jù)WHO的數(shù)據(jù)，季節(jié)性流感流行每年導致全球300萬～500萬例嚴重病例和30萬～50萬人死亡[6]。隨著新冠病毒變異株——奧密克戎的出現(xiàn)，讓疫苗接種工作形勢更加復(fù)雜。此外，針頭恐懼癥是一種普遍存在的疫苗接種猶豫問題，由于疼痛和針頭恐懼癥引起的注射焦慮在人群中非常普遍。對針頭的恐懼在兒童(33%～63%)和成年人(14%～38%)中都很常見[7-8]，可能導致患者依從性差，以及照顧者、臨床醫(yī)生和衛(wèi)生專業(yè)人員的針刺焦慮[7,9]。鑒于新冠肺炎疫情大流行，對針頭的恐懼和對密集人群的管控升級可能導致易感人群拒絕接種疫苗[10]。為適應(yīng)當前流行病防控要求并推進疫苗接種速度和質(zhì)量升級，目前迫切需要新的疫苗注射技術(shù)。

在過去的幾年里，無針注射技術(shù)已經(jīng)升級換代，以解決注射疼痛和針頭焦慮的相關(guān)問題。盡管僅限于專業(yè)醫(yī)療人員使用，但目前已經(jīng)得到了積極的反饋[11-12]，在醫(yī)療行業(yè)逐步得到推廣應(yīng)用[13-15]。盡管無針注射相關(guān)的疼痛與有針注射相當，但人群強烈支持無針注射方法[13]，主要是引起二次傷害的風險會明顯降低。重要的是氣壓式無針連續(xù)接種方法非常適用于快速大量的免疫接種并能有效降低財政支出，以應(yīng)對傳染病的大流行[16]。

本研究中，通過準確性試驗發(fā)現(xiàn)，分別在100～120 PSI個氣壓和200～240 PSI個氣壓時，無針肌內(nèi)免疫可以準確的將疫苗注射入SD大鼠和巴馬小型豬的后肢肌內(nèi)部位并達到有效接種深度，保證疫苗的抗原廣泛地與抗原提呈細胞接觸，啟動機體免疫反應(yīng)，該無針接種裝置可以根據(jù)不同人群皮膚特點調(diào)節(jié)氣壓，適應(yīng)不同人群的疫苗接種需求。免疫原性試驗中，有針和無針肌內(nèi)注射均存在劑量線性關(guān)系，無針免疫30 μg HA抗原，大鼠和小型豬均可達到免疫的最佳效果。與有針肌內(nèi)注射相比，相同劑量組實驗動物產(chǎn)生的針對不同亞型病毒的中和抗體效價無明顯差異，證明無針肌內(nèi)注射與有針肌內(nèi)注射刺激機體產(chǎn)生中和抗體的能力相同，提示在免疫原性方面，無針肌內(nèi)注射完全可以代替有針注射，具有等效性、非劣效性。在誘導產(chǎn)生免疫保護性抗體研究中，不同劑量無針肌內(nèi)免疫后，實驗動物產(chǎn)生的抗體均表現(xiàn)出了良好的免疫保護效果。

綜上所述，本研究成功完成無針肌內(nèi)注射四價流感裂解疫苗品種臨床前試驗的有效性和安全性評價，證明是一種良好的免疫接種方法，為傳染病疫苗快速、安全、高效免疫接種提供了新的技術(shù)手段。此外，鑒于成功實施國家新冠肺炎疫苗接種計劃的迫切需要，需要更廣泛地使用無針注射方案，本研究也為正在進行的無針肌內(nèi)注射新冠肺炎亞單位疫苗品種的臨床前研究工作奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)，以使無針肌內(nèi)注射裝置更好地推廣應(yīng)用。