阿司匹林丁香酚酯對肝臟主要藥物代謝酶活性的影響

陶 琦，郝若晨，劉希望，秦 哲，李世宏，白莉霞，李劍勇，楊亞軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

藥物進(jìn)入體內(nèi)后，有些藥物能夠提高肝臟微粒體藥物代謝酶系(藥酶)的活性，從而提高藥物代謝速率，稱為酶的誘導(dǎo)；或者使藥酶的活性降低，使其代謝藥物的速率減慢，稱為酶的抑制。藥酶的誘導(dǎo)或抑制均可影響藥物代謝的速率；當(dāng)2種或2種以上的藥物在同時或前后序貫用藥時，如果在代謝環(huán)節(jié)產(chǎn)生了藥酶的誘導(dǎo)或抑制，使療效增強(qiáng)甚至產(chǎn)生毒副作用，或療效減弱甚至治療失敗，此稱之為代謝性藥物相互作用(metabolic drug interaction)[1]。隨著藥物聯(lián)合使用越來越普遍，藥物之間的代謝性相互作用愈顯重要。在臨床用藥中，相當(dāng)部分的藥物不良反應(yīng)是由代謝性藥物相互作用引起的，其發(fā)生率占藥代動力學(xué)相互作用的40%，而代謝性相互作用的96%是由肝臟微粒體細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)(cytochrome P450,CYP450)介導(dǎo)的[2-3]。研究藥物對CYP450酶系的影響，可以預(yù)測其在體內(nèi)可能引起的代謝性藥物相互作用，進(jìn)而為臨床藥物相互作用試驗提供參考。因此，在新藥的安全性評價中，研究藥物對CYP450酶的活性影響具有重要意義。

目前，歐美各國已經(jīng)將藥物對CYP450酶活性影響的測定用于代謝及新藥的篩選研究，并將其列為新藥研究中必須進(jìn)行的一項試驗[4-6]。我國于2021年頒布了《藥物相互作用研究指導(dǎo)原則(試行)》，明確了化學(xué)藥物相互作用研究的具體方法，生物制品、中藥和天然藥物可參照執(zhí)行[7]。

阿司匹林丁香酚酯(aspirin eugenol ester,AEE)是利用結(jié)構(gòu)拼合的前藥原理，以丁香酚(Eug)對阿司匹林(Asp)進(jìn)行酯化修飾而合成的一種新型藥用化合物，具有很好的成藥性。研究表明，AEE具有確切的抗炎[8]、抗氧化[9-10]、降血脂[11-12]、預(yù)防動脈粥樣硬化[11-12]、預(yù)防血栓形成[15-17]和抗急性肝損傷作用[18]。前期研究主要集中在藥理與毒理方面，該藥物對CYP450酶活性的影響尚不清楚。因此，本試驗選擇SD大鼠和C57小鼠為研究對象，將其分為空白對照組與試驗組，采用ELISA方法，考察AEE對CYP450酶的6種主要亞型CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6和CYP2C9活性的影響，預(yù)測AEE在動物體內(nèi)可能引起的代謝性藥物相互作用，為研究AEE與其他藥物的相互作用及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為其獸醫(yī)臨床試驗研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑AEE(含量99.8%，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制，批號：20190815)；羧甲基纖維素鈉，大鼠CYP1A2試劑盒(批號：ml592615-J)，大鼠細(xì)胞色素氧化酶2C8(CYP2C8)試劑盒(批號：ml696555-J)，大鼠細(xì)胞色素P450家族成員2C9(CYP2C9)試劑盒(批號：ml846955-J)，大鼠細(xì)胞色素P450家族成員2C19(CYP2C19)試劑盒(批號：ml565952-J)，大鼠細(xì)胞色素P450酶亞型2D6(CYP2D6)試劑盒(批號：ml986556-J)，大鼠細(xì)胞色素P450家族成員3A4(CYP3A4)試劑盒(批號：ml365254-J)，小鼠CYP1A2試劑盒(批號：ml875116-J)，小鼠細(xì)胞色素P450氧化酶2C8(CYP2C8)試劑盒(批號：ml763516-J)，小鼠細(xì)胞色素P450家族成員2C9(CYP2C9)試劑盒(批號：ml563432-J)，小鼠細(xì)胞色素P450家族成員2C19(CYP2C19)試劑盒(批號：ml578931-J)，小鼠細(xì)胞色素P450酶亞型2D6(CYP2D6)試劑盒(批號：ml963546-J)，小鼠細(xì)胞色素P450家族成員3A4(CYP3A4)試劑盒(批號：ml568741-J)，以上試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)(索萊寶，批號：D1040-500)；烏拉坦(NJKOCED)；蛋白酶抑制劑(Thermo Fisher，貨號：36978)。

1.2 實驗動物40只清潔級SD大鼠，雄性，1月齡，體質(zhì)量110～120 g；40只清潔級C57小鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，均購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，動物生產(chǎn)許可證號：NKMYD201907018。

1.3 溶液配制稱取羧甲基纖維素鈉適量，用蒸餾水配制成0.5%的溶液。試驗前將AEE用研缽研磨成細(xì)粉。將研磨的AEE混懸在 0.5%的羧甲基纖維素鈉中，配制成質(zhì)量濃度為20 g/L的混懸液備用。

1.4 試驗分組及給藥方式將SD大鼠及C57小鼠，分別隨機(jī)分為空白對照組和試驗組，每組20只。空白組灌服0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液；試驗組灌服AEE(54 mg/kg)。每天1次，連續(xù)給藥3周后，每組隨機(jī)選取10只，禁食不禁水過夜，腹腔注射烏拉坦麻醉后，迅速處死，取出肝臟，用預(yù)冷的PBS(4℃預(yù)冷2 h)沖洗組織表面，去除表面殘留的血液。各組的剩余大鼠，于停藥2周后，以相同方式采集肝臟。

1.5 樣品采集與處理將肝臟樣品測質(zhì)量后剪碎，與PBS(PBS中加入了蛋白酶抑制劑)按比例(1 g∶9 mL)混合，置于勻漿機(jī)中充分均質(zhì)后，進(jìn)行超聲破碎，以使進(jìn)一步裂解，然后4℃、5 000×g離心10 min，取上清液備用。上述操作均在冰浴條件下進(jìn)行。

1.6 肝臟藥物代謝酶活性的測定設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行測定，在450 nm波長處測定各孔的D值。以所測標(biāo)準(zhǔn)品的D值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的D值代入方程，計算出樣品中酶的活性。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠與C57小鼠體質(zhì)量變化受試動物適應(yīng)一段時間后，開始正式試驗。定期對其體質(zhì)量進(jìn)行記錄。如圖1所示，2組SD大鼠的體質(zhì)量在給藥和停藥期間無顯著性差異(P>0.05)。如圖2所示，2組C57小鼠的體質(zhì)量在給藥和停藥期間無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 C57小鼠隨時間體質(zhì)量變化

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立根據(jù)試劑盒說明書分別建立SD大鼠和C57小鼠肝臟藥物代謝酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，SD大鼠和C57小鼠CYP450酶的6種主要亞型CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上(圖3，4)。說明在各質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，可以進(jìn)行下一步試驗。

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型

2.3 給藥后肝臟藥物代謝酶活性如圖5所示，SD大鼠連續(xù)灌服給藥3周后，與對照組比較，AEE對CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2的活性有顯著的抑制作用(P<0.05)，對CYP2C8的活性有顯著的誘導(dǎo)作用(P<0.05)，而對CYP2D6、CYP2C9的活性無顯著影響(P>0.05)。

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型。與空白對照組相比*P<0.05。下同

如圖6所示，C57小鼠在連續(xù)灌藥3周后，其酶活性結(jié)果與SD大鼠相似，即對CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6的活性有顯著抑制作用(P<0.05)，對CYP2C8的活性有一定的促進(jìn)作用(P<0.05)，對CYP2C9無顯著影響(P>0.05)；然而，AEE給藥后，C57小鼠CYP2D6的活性亦出現(xiàn)了明顯的抑制(P<0.05)。

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型

2.4 停藥后肝臟藥物代謝酶活性如圖7所示，SD大鼠停藥2周后，與對照組比較，僅CYP2C19的活性尚未恢復(fù)，而其余藥酶活性皆有一定的恢復(fù)，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型

如圖8所示，C57小鼠停藥2周后，與對照組比較，發(fā)現(xiàn)只有CYP2C19的活性沒有恢復(fù)，而其余藥酶活性都有一定的恢復(fù)，與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

A～F.分別為CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9亞型

2.5 AEE對2種實驗用鼠的肝臟主要藥物代謝酶活性的影響AEE試驗組與空白對照組2組實驗鼠，在試驗期間體質(zhì)量無顯著性差異(P>0.05)，說明AEE在本試驗期間對實驗鼠體質(zhì)量無顯著性影響。本試驗主要考察了AEE對CYP450酶的6種亞型：CYP3A4、CYP2C8、CYP2C19、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9的影響以及影響后的自我恢復(fù)。結(jié)果顯示，AEE對CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2的活性有一定的抑制作用(P<0.05)，對CYP2C8的活性有一定的誘導(dǎo)作用(P<0.05),而CYP2C9的活性無顯著性差異(P>0.05)；停藥2周后，發(fā)現(xiàn)只有CYP2C19的活性沒有恢復(fù)，而其余藥酶活性都有一定的恢復(fù)，與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)，詳見表1。

表1 藥酶(CYP)活性變化

3 討論

CYP450酶屬于血紅素蛋白基因超家族，編碼一系列的代謝酶，主要存在于肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[18]。該酶參與了大多數(shù)內(nèi)源性和外源性化合物的代謝，藥物的代謝速率依賴于其活性。已知的CYP450中主要有CYP1、CYP2、CYP3 三個家族，參與機(jī)體內(nèi)的內(nèi)源性和外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化[20]。CYP1A2是CYP450酶超家族中CYP1的重要亞型，主要分布在肝臟，參與約5%的臨床藥物，如咖啡因、非那西丁、茶堿、氯氮平和三環(huán)類抗抑郁藥的代謝過程，同時在前致癌物與前毒物的生物轉(zhuǎn)化過程中也起到了重要的作用[21]。CYP2C這個家族是CYP450超家族中最大的亞家族，包括CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C19等多個亞型[22-24]。CYP2D6是一種主要的藥物代謝酶，盡管只占肝臟酶總量的2%左右，但負(fù)責(zé)消除超過20%～30%的臨床使用藥物[25]。

CYP450酶的活性可被外源化合物影響，呈現(xiàn)可誘導(dǎo)性或可抑制性，從而在聯(lián)合用藥的過程中產(chǎn)生藥物-藥物相互作用，使得藥效降低或發(fā)生藥物不良反應(yīng)[26]。一些CYP450可被誘導(dǎo)，而有些卻對此不敏感；前者稱為誘導(dǎo)性P450，后者稱為構(gòu)成性P450[27]。有誘導(dǎo)作用的化合物大多數(shù)是該酶的底物或類似物[28]，在生物合成中的作用是催化。化合物對CYP450酶的抑制可分為4類：可逆性競爭抑制、可逆性非競爭抑制、不可逆性抑制、干擾蛋白質(zhì)合成。可逆性競爭抑制：同一種酶的兩種底物競爭相同活性部位互為抑制，這是由底物重疊性的特點所決定的。如，美托洛爾和異喹胍都是CYP2D6的底物，當(dāng)它們同時存在時，就存在競爭抑制[29]。可逆性非競爭抑制過程：物質(zhì)本身可能無抑制作用，但其代謝產(chǎn)物與相應(yīng)酶的親和力較高，從而抑制物質(zhì)本身的進(jìn)一步代謝。隨著代謝產(chǎn)物的消除，這種抑制作用也隨之消除。如，食用調(diào)味品的成分黃樟醚的代謝過程[30]。不可逆性抑制：P450結(jié)構(gòu)被破壞或造成蛋白質(zhì)永久失活。如，農(nóng)藥1605、馬拉硫磷對P450的抑制作用[30]。干擾蛋白質(zhì)合成：動物機(jī)體若營養(yǎng)不良或有肝臟疾病，可抑制蛋白質(zhì)P450的合成，從而抑制P450的活性。研究藥物對CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制，對于臨床合理用藥、提高藥物療效、降低藥物的毒副作用具有重要意義。因此，本試驗采用ELISA方法考察AEE對2種實驗鼠的肝臟主要藥物代謝酶活性的影響。

CYP2D6是CYP450酶系中重要的一種氧化代謝酶,其基因多態(tài)性對酶的活性有著至關(guān)重要的影響,是構(gòu)成藥物代謝個體差異和種族差異的基礎(chǔ)[31-32]，CYP2D6基因多態(tài)性對藥物代謝起著重要的作用。本試驗中AEE對SD大鼠和C57小鼠的CYP2D6活性的影響存在差異，原因可能是由于2種實驗鼠的CYP2D6的基因型有差異，從而導(dǎo)致AEE對2種實驗鼠的CYP2D6活性影響有一定的差異。

CYP3A4是CYP450酶中最重要的成分，約占CYP450酶總量的30%～40%，該酶在許多內(nèi)外源化合物的代謝中起著重要作用。本試驗結(jié)果表明AEE能夠抑制CYP3A4的活性，研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林也能夠抑制CYP3A4的活性[33-34]，提示AEE作為阿司匹林的衍生物，作用效果可能與阿司匹林相似。

CYP2C19是S-MP4羥化酶(S-美芬妥英羥化酶)[35]，是第一代質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑等藥物的最主要代謝酶，其中奧美拉唑90%都是通過CYP2C19進(jìn)行代謝的[36]。而AEE對CYP2C19的活性具有抑制作用，提示AEE與奧美拉唑聯(lián)用，可能會提高奧美拉唑?qū)ο罎兊闹委熜Ч?/p>

CYP1A2是CYP450酶中CYP1的重要亞型，主要分布在肝臟，參與約5%臨床藥物代謝。其活性與藥物的療效或毒性以及某些腫瘤的易感性密切相關(guān)，具有重要的生理學(xué)和毒理學(xué)意義[37-38]。AEE對CYP1A2的活性具有抑制作用，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

多種重要的藥物都可作為CYP2C8的底物，包括抗癌藥物、抗心律不齊藥物、降血糖藥物、抗癲癇藥物、HMG-CoA還原酶抑制藥物(他汀類藥物)等，紫杉醇是CYP2C8的特征性底物[39]。紫杉醇(paclitaxel)是臨床常用的抗腫瘤藥，主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的治療，紫杉醇轉(zhuǎn)化為其主要代謝產(chǎn)物6-羥基紫杉醇是由CYP2C8主要負(fù)責(zé)[40]。AEE對CYP2C8的活性有一定的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明，AEE與紫杉醇聯(lián)用，可能會提高紫杉醇的抗腫瘤效果。

目前，關(guān)于藥物之間相互作用的研究，主要集中在藥物對肝臟藥物代謝酶的誘導(dǎo)或抑制階段，很少有關(guān)于被誘導(dǎo)或被抑制的肝臟藥物代謝酶在停藥后的自我恢復(fù)性研究。基于此，本試驗還考察了AEE對被抑制或被誘導(dǎo)的肝臟藥物代謝酶停止給藥后的影響。根據(jù)SD大鼠和C57小鼠的結(jié)果可以得出：停藥2周后，發(fā)現(xiàn)只有CYP2C19的活性沒有恢復(fù),而其余藥酶活性都有一定的恢復(fù)，與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)。CYP2C19酶的活性不僅僅與遺傳多態(tài)性相關(guān)，還與其他一些外在因素相關(guān)。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因中存在30多個等位基因的突變體[40]。其中CYP2C19*1是編碼正常酶活性的野生型。CYP2C19*2、CYP2C19*3為主要突變基因型,所表達(dá)的酶活性減低[42]。 AEE對CYP2C19的活性具有抑制作用，且該酶的活性在停藥后2周仍未恢復(fù)。原因可能是服用AEE后引起CYP2C19基因發(fā)生了突變，從而導(dǎo)致CYP2C19酶活性降低，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，AEE的臨床使用，可能導(dǎo)致動物肝臟藥物代謝酶的抑制或誘導(dǎo)，但停止用藥后短期內(nèi)可以恢復(fù)。結(jié)果表明，可以通過停止服用AEE，從而避免其與其他藥物間的相互作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，AEE在臨床使用中應(yīng)注意由CYP450酶介導(dǎo)而可能發(fā)生的藥物間的相互作用。臨床使用AEE與其他藥物合用時，要特別注意可能出現(xiàn)的藥效學(xué)改變或出現(xiàn)的不良反應(yīng)。