Krt19在小鼠早期妊娠子宮的表達和調節

王 靜,徐 鵬,王夢媛,孫 宇,孟令帥,李世杰,馬興紅*

(1.東北農業大學 生命科學學院 黑龍江省動物細胞與遺傳工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫科大學 心肌缺血省部共建教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150001)

早期妊娠的質量對妊娠晚期的事件和妊娠結局有重要影響。在小鼠早期妊娠中，最重要的事件包括胚胎著床和蛻膜化。胚胎著床是指具有著床能力的囊胚與處于接受態的子宮建立緊密聯系的過程[1]。在小鼠中，根據早期妊娠子宮對胚胎著床敏感性和類固醇激素需求的不同，可以將子宮的狀態分為3個主要時期：接受前期(妊娠1～3 d)、接受期(妊娠4 d)和非接受期(妊娠5 d以后)[2]。在小鼠中，卵巢分泌的甾類激素孕酮(P4)和雌激素(E2)通過結合各自的受體(P4受體：PR-A與PR-B；E2受體：ERα與ERβ)，調節子宮內膜細胞的增殖和分化[3]。其中，ERα、PR-A是參與調節小鼠子宮接受態和著床的主要受體[4-5]。小鼠胚胎著床發生在妊娠第4天晚上22:00點左右。著床的胚胎進一步刺激圍繞其周圍的基質細胞分化為不同形態和功能的蛻膜細胞，此過程稱為蛻膜化。蛻膜提供給妊娠早期胚胎營養，限制胚胎過度侵入子宮，保護胚胎免于母體免疫攻擊[6]。

胚胎著床前后，子宮上皮細胞經歷細胞骨架重塑的過程，而維持上皮細胞結構完整性和免受外部壓力的蛋白可能參與妊娠過程。哺乳動物胞質內細胞骨架由微絲、微管和中間絲構成，每一種成分都具有獨特的結構和功能[7-8]。角蛋白是一種主要表達于上皮細胞的中間絲，作為細胞骨架結構中的一員，參與細胞的分裂、遷移以及分化、凋亡等過程[9]，對維持細胞結構的完整性和穩定性具有重要作用[10]。人類功能性角蛋白有54種，即28種Ⅰ型和26種Ⅱ型角蛋白。角蛋白19(Keratin19，Krt19)，相對分子質量為40 kDa，屬于Ⅰ型角蛋白，其是腸、腎集合管、膽囊、間皮和分泌腺等上皮細胞中最具代表性的蛋白質之一[11-12]，還作為多種癌癥的預后標志物[13-14]。鑒于Krt19在正常和癌變的上皮細胞中均表達，參與細胞骨架的形成，而胚胎著床前后涉及子宮上皮細胞骨架的重塑，推測Krt19可能參與該過程的調節。

為了探索在小鼠早期妊娠子宮中Krt19的表達與調節，本研究利用原位雜交、免疫組織化學、Western blot、real-time PCR等技術，結合小鼠早期妊娠模型、激素處理模型、延遲著床與激活模型和人工誘導蛻膜化模型，研究了Krt19 mRNA以及蛋白在小鼠子宮中的表達情況。研究結果可為深入了解Krt19在胚胎著床及蛻膜化過程中的作用及調節機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗室所用的ICR品系小鼠(6～8周齡)購自遼寧長生生物技術股份有限公司。控制其飼養環境，室溫22℃，交替光照環境(12 h光照，12 h黑暗)，自由攝食及飲水。

1.2 主要試劑Krt19抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購自Abclonal公司；GAPDH抗體購自Proteintech公司。

1.3 早期妊娠將健康性成熟的雄鼠與雌鼠按1∶2合籠，次日見栓并且陰道涂片發現精子的雌鼠記為妊娠第1天，分別在每日8:30完成妊娠1～8 d的小鼠子宮組織的收集。

1.4 類固醇激素處理切除健康性成熟雌鼠的雙側卵巢，恢復2周后皮下注射。對照組(Oil，Sigma)：芝麻油，0.1 mL/只；E2處理組(E2，Sigma)：100 ng E2，0.1 mL/只；P4處理組(P4，Sigma)：1 mg P4，0.1 mL/只；E2與P4共處理組(E2+P4)：(100 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只。以上試劑均以芝麻油為溶劑進行配制，24 h后取材。

1.5 延遲著床與激活妊娠4 d的雌鼠切除雙側卵巢，分別做以下處理。延遲著床：妊娠5～7 d注射1 mg P4，0.1 mL/只，8 d取材。激活：7 d，皮下注射(25 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只，終止延遲著床。8 d，通過尾靜脈注射1%芝加哥藍以確定激活成功。

1.6 人工誘導蛻膜化結扎性成熟雄鼠恢復后，與雌鼠1∶2合籠，見栓當天的雌鼠記為假孕第1天(PD1)。給PD4雌鼠的一側子宮角注射25 μL芝麻油，另一側不做任何處理作為對照，PD8完成取材。

1.7 原位雜交從NCBI數據庫中獲取小鼠Krt19基因的mRNA序列設計引物。Krt19引物為F：5′-GGTCAGTGTGGAGGTGGATTC-3′；R：5′-GGTGGGCAGATTGTTGTAGTG-3′,以cDNA為模板進行PCR擴增并純化產物，連接T載體，探針利用地高辛標記試劑盒(Roche公司)進行標記。

1.8 免疫組織化學石蠟切片于60℃烘片30 min。脫蠟，酒精梯度入水，抗原修復并冷卻至室溫，3%雙氧水處理10 min，馬血清室溫避光封閉1 h。4℃過夜避光孵育兔源Krt19多克隆抗體(1∶100)。HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶200)室溫避光孵育1 h。水洗，DAB顯色(中山金橋)，水洗，蘇木精對染1 min。氨水返藍、酒精梯度脫水和透明后封片。

1.9 Western blot檢測根據蛋白濃度，按照所需蛋白量進行點樣，電泳，轉膜，37℃搖床振蕩封閉1 h;使用Krt19多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜避光孵育。配制PBST用于洗膜，山羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃振蕩孵育1 h;PBST洗膜，使用增強型ECL發光液曝光拍攝，Image J軟件掃描條帶，計算灰度值。

1.10 real-time PCR檢測使用Primer 5.0設計引物，引物序列見表1。以小鼠子宮組織的cDNA為模板，使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)進行反轉錄。采用Amplied Biosystems?7500 real-time PCR System(Amplied Biosystems)儀器收集熒光信號，并利用2-ΔΔCt法分析結果。

表1 引物信息

2 結果

2.1 小鼠早期妊娠子宮中Krt19 mRNA和蛋白的表達原位雜交結果顯示，妊娠1～3 d，Krt19 mRNA在子宮上皮中表達比較強烈，且1 d信號最強,妊娠4 d的表達有所降低。與著床前相比，妊娠5～8 d的Krt19表達顯著降低。妊娠5 d，其在上皮中也有表達，但是比前4 d信號弱，并且微弱表達于胚胎周圍的子宮基質細胞中。妊娠6～8 d，Krt19 mRNA在胚胎周圍的初級蛻膜區以及次級蛻膜區也有表達。此外，在6～8 d的胚胎中也有表達(圖1A)。免疫組織化學結果與原位雜交結果基本一致，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～4 d子宮腔上皮和腺上皮中的表達比較強烈，并且1 d表達最強。在5 d的子宮腔上皮和腺上皮以及在胚胎周圍的基質細胞中也檢測到微弱的表達。妊娠6～8 d，在殘余的腔上皮中仍然檢測到了其表達，在胚胎周圍形成的初級蛻膜區以及次級蛻膜區也有表達，但是相比于1～4 d，著床后其表達較弱(圖1B)。real-time PCR結果與原位雜交結果一致(圖1C)。Western blot結果顯示，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～8 d子宮中的表達呈現逐漸下降的趨勢，其中1 d表達最高。胚胎著床后，Krt19蛋白表達相對于著床前較低，結果與免疫組織化學結果基本一致(圖1D，E)。

A.原位雜交結果；B.免疫組織化學結果；C.real-time PCR結果；D.Western blot結果(1～8.早期妊娠1～8 d);E.(D)中的灰度掃描結果。比例尺.100 μm；*** P<0.001

2.2 類固醇激素處理小鼠子宮中Krt19 mRNA和蛋白的表達原位雜交結果顯示，在4組模型中，Krt19 mRNA在子宮腔上皮和腺上皮中均有表達。但是，與對照組相比，Krt19 mRNA在E2處理子宮的腔上皮與腺上皮中的表達比較強烈(圖2A)。免疫組織化學結果與原位雜交結果相似(圖2B)。real-time PCR結果與原位雜交結果相符，Krt19 mRNA在E2處理組中表達顯著上調，差異極顯著(P<0.001)，在其他組無明顯變化(圖2C)。Western blot結果顯示，Krt19蛋白的表達情況與免疫組織化學結果基本一致(圖2D，E)。

A.原位雜交結果；B.免疫組織化學結果；C.real-time PCR結果；D.Western blot結果；E.(D)中的灰度掃描結果。比例尺.100 μm；** P<0.01；*** P<0.001

2.3 延遲著床與激活子宮中Krt19蛋白的表達為了進一步檢測Krt19的表達是否受著床胚胎活性狀態的影響，因此，建立了延遲著床與激活模型。延遲著床狀態子宮中的胚胎處于休眠狀態，被E2重新激活進而著床。利用免疫組織化學和Western blot技術對其進行檢測。免疫組織化學結果顯示，在延遲著床模型的子宮中，Krt19蛋白高表達于腔上皮與腺上皮中。當胚胎被E2激活發生著床后，在著床位點處腔上皮、腺上皮中表達相對較弱，并且著床位點周圍的基質細胞中也出現微弱表達。在非著床位點的上皮中，Krt19蛋白表達較強(圖3A)。Western blot結果與免疫組織化學的結果相一致，Krt19蛋白在延遲著床模型中的表達顯著高于激活模型中著床位點處(P<0.000 1)，同時，非著床位點的表達也顯著高于著床位點處(P<0.001；圖3B，C)。

A.免疫組織化學結果；B.Western blot結果；C.(B)中的灰度掃描結果。Activated-NI.激活模型的非著床位點；Activated-IS.激活模型的著床位點；Delayed.延遲模型子宮；比例尺.100 μm；*** P<0.001；**** P<0.000 1

2.4 人工誘導蛻膜化子宮中Krt19蛋白的表達為了進一步檢測Krt19在小鼠子宮中的表達是否受蛻膜化的調節，使用芝麻油誘導蛻膜化來制備人工誘導蛻膜化模型。為了對其進行定位和相對定量檢測，利用免疫組織化學和Western blot技術進行檢測。免疫組織化學結果顯示，在對照組中，Krt19蛋白強表達于腔上皮和腺上皮細胞中，基質細胞中未見表達。而在人工誘導蛻膜化小鼠子宮中，Krt19蛋白在蛻膜區表達(圖4A)。Western blot結果與免疫組織化學結果一致，蛻膜子宮中的Krt19蛋白表達明顯低于對照子宮中，差異極顯著(P<0.000 1；圖4B，C)。

A.免疫組織化學結果；B.Western blot結果；C.(B)中的灰度掃描結果。Decidualized.蛻膜子宮；Control.對照子宮；比例尺.100 μm；**** P<0.000 1

3 討論

本研究運用原位雜交、real-time PCR、免疫組織化學、Western blot技術檢測幾種小鼠模型中Krt19的表達模式，進而判斷其在小鼠妊娠過程中是否參與了胚胎著床過程以及是否受卵巢類固醇激素的調控。

子宮腔上皮細胞在正確的時間里進行增殖、分化和凋亡，才有利于滋養層細胞與母體子宮相互接觸，并發生著床[15]。隨著胚胎在子宮內的遷移和侵襲，這些機械應力會導致子宮上皮細胞骨架結構發生變化。角蛋白是細胞骨架結構的主要成員之一，可維持細胞結構的完整和穩定[16]。本試驗首先檢測了Krt19在早期妊娠子宮中的表達模式，發現其表達模式與上皮細胞的狀態有關。妊娠1～2 d的小鼠子宮上皮細胞在排卵前卵巢分泌的E2的作用下進行增殖。結果表明，Krt19在妊娠1～2 d子宮的腺上皮與腔上皮中高表達，妊娠第1天表達量最高。妊娠第3天，新形成的黃體分泌的P4會刺激基質細胞進行增殖，同時也會拮抗上皮細胞的增殖作用。妊娠第4天，著床前的E2會出現一個小峰值，而在該E2峰與P4共同的作用下，基質細胞的增殖作用更加明顯。同時，上皮細胞也是在這二者的作用下停止增殖進入分化狀態。而Krt19在接受期(第4天)的子宮中的表達有所下降。我們發現，上皮細胞停止增殖開始分化的同時，Krt19表達下降了。相關研究已表明，Krt19可以作為多種細胞的分化標志物[17-19]，與本試驗結果相符，提示Krt19可以作為子宮腔上皮分化的標志物。

胚胎著床過程中，E2和P4起著非常重要的作用。在妊娠過程中，很多基因的表達都受E2的上調，而E2是通過結合ER受體來發揮相應的作用。本研究結果顯示，Krt19在E2處理子宮中高表達。已有研究表明，在乳腺癌上皮細胞以及子宮內膜癌細胞中[20-23]，E2結合ER可以促進Krt19的表達。因此，推測Krt19在接受前期上皮中強烈的表達，可能是E2通過結合ER進行調節的。

隨著胚胎在子宮中繼續侵入，胚胎周圍的子宮內膜基質細胞分化為更大的圓形蛻膜細胞，此過程叫做蛻膜化[24-25]。蛻膜細胞也經歷廣泛的重塑以控制胚胎侵襲并適應不斷生長的胚胎[26]。6～8 d，隨著蛻膜化的進行，胚胎著床處的腔上皮逐漸凋亡，Krt19在子宮腔上皮仍然有表達，相比妊娠1～4 d較弱。并且在初級蛻膜區開始表達，繼而擴展到次級蛻膜區。人工誘導蛻膜化模型進一步驗證Krt19的表達是否受蛻膜化的影響。盡管Western blot結果表明，整個子宮組織Krt19蛋白在對照中的表達明顯強于蛻膜子宮。但免疫組織化學結果顯示，在蛻膜化的基質細胞中Krt19的表達比未發生蛻膜化的對照基質細胞的表達增強。以上說明，Krt19在小鼠子宮蛻膜化過程中可能起一定的作用。

此外，我們還發現，在6～8 d胚胎也檢測到了Krt19的表達。此前也有研究表明，在小鼠胚胎中，Krt19可能在交配后9.5 d之前就能檢測到[27]，而本試驗在更早的時間(6～8 d)就檢測到了Krt19的表達。TAMAI等[27]建立了Krt19基因敲除鼠，結果發現此鼠可育，并且胚胎發育與子代數目均正常，其又構建了Krt19和Krt8基因雙敲除小鼠，結果發現(Krt19-/-，Krt8-/-)其胚胎在E9.5～E10.5致死在子宮中。HESSE等[28]建立了Krt19和Krt18基因雙敲除鼠，同樣發現(Krt19-/-，Krt18-/-)其胚胎在E9.5左右死在子宮中，致死率高達100%。這2種基因敲除鼠胚胎致死的原因可能是由于小鼠胚胎發生過程中角蛋白細胞骨架缺乏，使滋養層細胞變得脆弱。由此我們發現，Krt19敲除鼠沒有出現任何明顯的表型，可能是Krt18補償的原因。而Krt19和Krt8或者Krt19和Krt18同時敲除，胚胎則會致死。這可能又提供了早期流產可能性的線索，即角蛋白表達異常，細胞骨架可能無法形成，導致滋養層缺陷以及母體和胚胎組織之間失去聯系，從而導致流產。

妊娠成功需要處于接受態的子宮和活性狀態的胚胎，才可以打開子宮的著床窗口，使得胚胎著床[29-30]。在延遲著床子宮中，Krt19蛋白僅高表達于腔上皮與腺上皮中，當胚胎被E2激活發生著床后，除在腔上皮、腺上皮中表達外，著床位點周圍的基質細胞中也出現微弱表達。Western blot定量檢測表明，Krt19蛋白在延遲著床中的表達顯著高于激活模型中著床位點，同時，非著床位點處的表達也顯著高于著床位點。以上結果提示，著床胚胎的活性狀態可能會影響Krt19在子宮中的分布。

綜上，本研究結果表明，Krt19在小鼠早期妊娠過程中可能參與胚胎著床與蛻膜化過程，并且受E2以及子宮內著床胚胎的活性狀態的調節，本研究為胚胎著床分子機理的研究提供了新的視角，也為臨床IVF胚胎著床失敗的原因提供了一定的線索。