牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株全基因組測序及生物學特性分析

吳 丹，羅潤波，黃家旗，蔡重振，卓瑪次仁，王萌浩，袁國意，張夢晨，李 彬，宋仁德，索朗斯珠*

(1.西藏農牧學院 動物科學院，西藏 林芝 860000；2.江蘇農業科學院 獸醫研究所，江蘇 南京 210014；3.國家肉牛牦牛產業技術體系 玉樹綜合試驗站，青海 玉樹 815000)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens，Cp)舊名魏氏梭菌(C.welchii)，屬于梭菌屬，革蘭陽性、產芽胞的大桿菌，常單個或成雙存在，常見于土壤、污水、沉積質、腐殖質、食物、糞便、人和其他脊椎動物腸道中[1]。產氣莢膜梭菌所產生的毒素是其致病的主要原因，通常可引起人和動物氣性壞疽(gas gangrene)、食物中毒、羔羊痢疾(lamb dysentery)、綿羊猝疽(struck)、牛腸毒血癥(enterotoxemia in cattle)和壞死性腸炎(necrotizing enteritis)等疾病[2]。牦牛源產氣莢膜梭菌能引起牦牛猝死綜合征[3]，病畜通常臨床表現出腹部鼓氣脹大，心臟、肝臟、脾臟、腎臟等實質器官出血性病變，急性出血性腸炎[4]，以及突然倒地死亡等癥狀，發病急，病程短，嚴重影響著牦牛養殖業的經濟發展[5]。本試驗以1株牦牛源產氣莢膜梭菌為研究對象，通過生化試驗、藥敏試驗、MIC測定以及全基因組測序等方法，對該菌進行基因組生物信息學分析、部分生物學特性研究以及探究其耐藥特性，為進一步了解牦牛源產氣莢膜梭菌基因功能、耐藥特性提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源在2020年夏末秋初，青海玉樹地區多地牦牛出現腹脹、腹瀉等癥狀，對死亡牦牛剖檢發現胃、腸道出血。在青霉素、鏈霉素、慶大霉素、復方新諾明等藥物的治療下未取得好的治療效果，西藏農牧學院預防獸醫實驗室采集新鮮腹瀉糞樣，并從中分離得到牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株。

1.2 主要試劑及儀器DNA聚合酶、dNTPs、DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；無菌脫纖維綿羊血購自北京Solarbio科技有限公司；厭氧產氣袋購自日本Mitsubishi Chemical公司；生化鑒定管購自杭州微生物有限公司；MIC試紙購自意大利Liofilchem公司；胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂培養基(TSC)、羊血瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基(MACC)、液體硫乙醇酸鹽培養基(FTG)、梭菌增菌培養基(RCM)、含鐵牛乳培養基、LB培養基(LB)、微生物藥敏試驗專用培養基(MH培養基)購自青島海博生物技術有限公司；凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司；PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 菌株復蘇將凍存的Qinghai-1菌株緩慢梯度升至室溫(-80℃→-20℃→4℃→室溫)，依次劃線接種于羊血瓊脂培養基、TSC培養基、MACC培養基，41℃厭氧培養18～24 h。挑單菌落接種于FTG、含鐵牛乳培養基，石蠟油液封，41℃培養12 h。革蘭染色后，利用顯微鏡對細菌進行鏡檢。

1.4 全基因組DNA提取及PCR擴增挑單菌落接種于RCM培養基中，石蠟油液封，41℃培養12 h，利用細菌基因組試劑盒提取Qinghai-1菌株全基因組DNA。合成細菌16S rRNA通用引物[6]、產氣莢膜梭菌常見毒素分型基因引物[7]分別對菌株DNA進行PCR擴增，擴增采用50 μL體系，引物信息見表1。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并通過凝膠成像系統拍照保存。

表1 PCR引物信息

1.5 生化特性分析參考伯杰細菌鑒定手冊[8]，將對數生長期的菌液分別接種于硫化氫、吲哚、乳糖、鼠李糖、靛基質、木糖、纖維二糖、棉子糖、葡萄糖、麥芽糖、水楊苷、甘露醇、山梨醇、尿素、蔗糖、酪蛋白、脂酶、賴氨酸、鳥氨酸、硝酸鹽、明膠、阿拉伯糖、卵磷脂酶、甘露糖等24種細菌生化鑒定管對Qinghai-1菌株進行生化特性研究。

1.6 藥敏試驗與最低抑菌濃度(MIC)測定調整菌液濃度為0.5個麥氏濁度(1×108～2×108CFU/mL)，均勻涂布于MH培養基上，采用E-test法[9]和Kirby-Bauer紙片擴散法測定Qinghai-1菌株對10種常用抗菌藥物(頭孢噻肟、氨芐西林、慶大霉素、復方新諾明、青霉素、四環素、多黏菌素B、紅霉素、鏈霉素、桿菌肽)的MIC及抗菌藥物的敏感性。讀取MIC紙條環尖所對應紙條上的數值并測量紙片擴散法中抑菌圈大小，根據CLSI推薦的《抗菌藥物敏感性試驗標準》對測定結果進行判定[10]。

1.7 細菌全基因組測序分析將1.4中提取的細菌全基因組DNA用Qubit Fluorometer和NanoDrop分別檢測DNA的濃度和純度，將質檢合格的樣品送至擎科生物科技有限公司，并基于Nanopore三代測序技術平臺和illumina二代測序技術平臺進行測序，再采用Pilon(1.23)[11]軟件進行糾錯以及Unicycler(0.4.9)[12]軟件進行組裝。組裝完成后利用Prokka(1.13)[13]軟件對組裝后的全基因組進行編碼基因預測，與8大數據庫(UniProt[14]、KEGG[15]及 KEGG Pathway、GO[16]、Pfam[17]、COG[18]、TIGERfams[19]、RefSeq、NR)的基因功能做BLAST+(2.9.0+)[20]比對并注釋。隨后通過Diamond blastp[21]基于VFDB(毒力因子數據庫)對目的蛋白質序列進行注釋，用于收集Qinghai-1菌株毒力因子的信息；通過CARD[22](耐藥基因數據庫)網站(http://arpcard.mcmaster.ca)中選擇RGI(Resistance Gene Identifier)模式分析Qinghai-1菌株抗性基因及耐藥種類。

1.8 上傳數據并構建遺傳進化樹將牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株全基因組核苷酸序列上傳至NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得GenBank 登錄號，并通過與其他已公開序列比對，下載相關序列，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法(Neighbor Joining)構建Qinghai-1菌株遺傳進化樹。

2 結果

2.1 細菌生長特征將接種好的培養基置于41℃恒溫培養箱中，厭氧培養18～24 h，觀察并記錄細菌及菌落在不同培養基的生長狀況(表2)，細菌在不同培養基生長形態見圖1A～E。革蘭染色鏡檢結果顯示：菌體大小為0.6～2.4 μm×1.3～19.0 μm，其兩端鈍圓，呈單個或雙個排列，有莢膜、無鞭毛的革蘭陽性粗大桿菌(圖1F)。

表2 不同培養基Qinghai-1菌株生長特征

A.羊血瓊脂培養基；B.TSC培養基；C.MACC培養基；D.FTG培養基(左.對照組；右.試驗組)；E.含鐵牛乳培養基(左.對照組；右.試驗組)；F.革蘭染色(1 000×)

2.2 細菌 16S rRNA和四重分型PCR擴增結果PCR擴增結果顯示，16S rRNA PCR產物凝膠電泳在約1 400 bp處出現條帶，四重分型PCR產物凝膠電泳僅在325 bp處出現條帶(圖2)，與預期條帶大小相符合。經測序比對和毒素基因分型得到牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株為A型產氣莢膜梭菌。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株

2.3 生化反應結果生化試驗結果顯示：Qinghai-1菌株在硫化氫、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、賴氨酸、鳥氨酸、卵磷脂酶、明膠、硝酸鹽、甘露糖、酪蛋白共12種生化鑒定管中呈陽性反應，有產酸產氣或生長動力等試驗現象出現。在其余12種生化鑒定管中呈陰性反應，生化管中無生化反應現象產生。

2.4 藥敏試驗及MIC測定結果結果如表3所示，藥敏試驗與MIC測定結果相同。

表3 常用藥物MIC測定結果

2.5 Qinghai-1菌株遺傳進化樹通過利用MEGA 7.0軟件構建Qinghai-1菌株遺傳進化樹，結果顯示，Qinghai-1菌株與中國云南山羊源(MK156683)產氣莢膜梭菌處于同一分支，與西藏安多縣牦牛源(MN960263、MN960262)產氣莢膜梭菌和西藏班戈縣牦牛源(MN960261)產氣莢膜梭菌卻有著相對較遠的親緣關系(圖3)。

圖3 Qinghai-1菌株16S rRNA遺傳進化樹

2.6 Qinghai-1菌株基因組序列分析基因組組裝結果顯示，基因組長度3 042 374 bp，GC含量為28.58%，共含2 906個基因，2 721個CDS區，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重復序列和1個基因島，不含CRISPR序列(表4)。利用預測得到的基因組信息，繪制基因組圈圖(圖4)。

表4 牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株基因組基本信息

注：由外到內依次：第1圈.基因組序列信息；第2圈.基因組序列的GC含量曲線；第3圈.基因組序列的GC skew曲線；第4圈.二代測序深度及覆蓋度信息；第5圈.三代測序深度及覆蓋度信息；第6圈.展示了參考基因組中的基因編碼區(CDS)以及非編碼RNA區(rRNA、tRNA)，以內外兩層表示，外層代表正鏈，內層代表負鏈

2.7 Qinghai-1菌株基因組功能注釋與8大數據庫的基因功能比對注釋結果顯示，UniProt數據庫1 721 個基因，KEGG數據庫849個基因，KEGG Pathway數據庫815個基因，GO數據庫1 643個基因，Pfam數據庫2 406個基因，COG數據庫1 196個基因，TIGERfams數據庫1 669個基因，RefSeq數據庫2 679個基因，NR數據庫2 261個基因(圖5)。

注：左側為通用數據庫基因注釋統計；右側為共有和特有統計，上方為數目統計，下方為共有或特有數據庫的標注

GO(gene ontology，國際標準化的基因功能分類體系)數據庫將Qinghai-1菌株基因的功能分為細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物學過程(biological process)3個方面(圖6)，生物過程的各基因功能數量相對平均，富集程度最高的為翻譯過程(translation)共有63個基因；細胞組分的部分基因功能數量差異明顯，其中富集程度前3的為質膜(plasma membrane)共384個基因，細胞質(cytoplasm)共376個基因，質膜組成部分(integral component of plasma membrane)共316個基因；分子功能中的ATP結合功能(ATP binding)基因富集程度最高，共320個基因。

注：橫坐標為 GO 各分類內容，縱坐標為基因數目

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫從其對基因產物的代謝途徑和功能的不同通路[23]將Qinghai-1菌株基因組基因分為5個大類和28個小類(圖7)，其中富集最高的基因代謝途徑為代謝類(metabolism)中的碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)共有267個基因。

COG(cluster of orthologous groups of proteins，基因產物直系同源分類)數據庫以細菌、藻類、真核生物具有完整基因組的編碼蛋白、系統進化關系為構建基礎[24]，將Qinghai-1菌株基因組基因分為20類(圖8)，其中基因數量富集程度前3位的功能途徑是翻譯、核糖體結構和生物發生(translation,ribosomal structure and biogenesis)，含145個基因；碳水化合物運輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)，含135個基因；氨基酸轉運和代謝(amino acid transport and metabolism)，含108個基因。

注：橫坐標為 Pathway 分類下注釋的基因數目；縱坐標為 Pathway 分類，不同顏色代表所屬的不同的大分類

注：橫坐標為COG各分類內容，縱坐標為基因數目

2.8 細菌毒力因子注釋VFDB數據庫對Qinghai-1菌株序列注釋結果顯示：注釋到237個與毒力因子有關的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相關因子。

2.9 耐藥基因注釋CARD數據庫對Qinghai-1菌株序列注釋結果顯示(圖9)：牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株僅含有1個耐藥性相關基因，即ClostridiumperfringensmprF基因，其主要通過抗生素靶標改變的方式來耐受肽類抗生素，該類抗生素常見的藥物有桿菌肽、多黏菌素B、黏菌素、萬古霉素、太古霉素、沙拉霉素等。

注：從內到外依次為分析種類、RGI運算方式、耐藥種類、耐藥基因

2.10 基因組序列登錄號牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株16S rRAN的基因序列登錄號為MW980090，全基因組序列登錄號為CP092481。

3 討論

本研究選用由本實驗室從青藏高原玉樹藏族自治州牦牛腹瀉糞樣中分離到的1株產氣莢膜梭菌為研究對象，通過PCR鑒定其為A型產氣莢膜梭菌。對其進行生化試驗探究，了解到了牦牛源產氣莢膜梭菌能發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖并產酸產氣，不發酵甘露醇或水楊苷；能液化明膠，不能消化已凝固的蛋白質等常規生化現象[2,25]，擴寬了牦牛源產氣莢膜梭菌生化譜，可為進一步研究牦牛源產氣莢膜梭菌代謝產物、代謝方式和代謝條件提供依據。通過E-test法和Kirby-Bauer紙片擴散法相互對照測定Qinghai-1菌株對10種常用抗菌藥物的敏感性。結果顯示，牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株對頭孢噻肟、氨芐西林、青霉素、四環素敏感，對慶大霉素、復方新諾明、多黏菌素B、鏈霉素、桿菌肽耐藥。通過全基因測序與CARD數據庫比對注釋可知，牦牛源產氣莢膜梭菌Qinghai-1菌株含有mprF抗性基因，能通過對抗生素靶標改變對肽類抗生素產生耐藥。根據本次藥敏試驗結果和耐藥基因注釋結果推薦在今后的養殖生產中交叉使用β-內酰胺類、四環素類藥物對牦牛源產氣莢膜梭菌病進行預防和治療，避免繼續使用氨基糖苷類、磺胺類、肽類藥物用于治療產氣莢膜梭菌引起的疫病。

Qinghai-1菌株基因組組裝結果顯示，其基因組長度3 042 374 bp，GC含量為28.58%，共含2 906個基因，2 721個CDS區，94段tRNA，10段rRNA，60段miscRNA，1段tmRNA，968段重復序列和1個基因島，不含CRISPR序列。GO數據庫注釋結果顯示，生物過程富集程度最高的為翻譯過程；細胞組分富集程最高的為質膜；分子功能富集程度最高的為ATP結合功能，通過細胞組分、分子功能、生物學過程3個方面來全面描述了Qinghai-1菌株基因和基因產物的屬性。KEGG數據庫注釋結果顯示，富集程度最高的基因代謝途徑為碳水化合物代謝，通過5個大類和28個小類共同描述了Qinghai-1菌株基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物的功能，可以進一步研究基因在生物學上的復雜行為[26]。COG數據庫從宏觀認識Qinghai-1菌株的基因功能分布特征上，將Qinghai-1菌株注釋到COG數據庫的1 196個基因分為20類，其中基因數量富集程度最高的功能途徑是翻譯、核糖體結構和生物發生。全基因組測序的結果對牦牛源產氣莢膜梭菌遺傳變異性、基因功能、毒力機制和耐藥機制等方向的研究提供理論依據，為分析高原牦牛源產氣莢膜梭菌分子生物學特性提供支撐。

VFDB數據庫對收集到的Qinghai-1菌株毒力因子注釋結果顯示，注釋到237個與毒力因子有關的基因，主要包括α毒素基因(plc)、θ毒素基因(pfoA)、κ-毒素基因(colA)、外源-α-唾液酸酶基因(nanl)、α-梭菌蛋白酶基因(cloSI)、唾液酸酶基因(nanH)等毒力相關因子。該結果為研究Qinghai-1菌株的致病機制提供了依據。最后，本試驗從生物學特性和全基因組測序兩個方面完成了對Qinghai-1菌株的耐藥特性和基因組信息分析，并將其上傳至NCBI基因組數據庫獲得登錄號：CP092481，豐富了產氣莢膜梭菌基因庫宿主的類型，為進一步了解牦牛源產氣莢膜梭菌耐藥基因和遺傳進化信息提供了理論參考。