兔源強毒力金黃色葡萄球菌熒光定量PCR檢測方法的建立

王錦祥，林松華，陳冬金，孫世坤，陳巖鋒，桑 雷，謝喜平

(福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013)

兔葡萄球菌病是兔的常發病和多發病，是危害兔產業發展的重要疫病之一。該病的病原是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)，臨床上常見乳房炎、腳皮炎以及組織和器官的膿腫，也可見呼吸道癥狀[1-2]。

兔產業是福建省畜牧業的重要組成部分。福建統計年鑒顯示，2020年年末福建省家兔存欄量和出欄量分別為565.15萬只和1 125.86萬只，均居全國前列。兔葡萄球菌病在福建省兔群中廣泛流行。根據分離鑒定的兔源金黃色葡萄球菌的毒力差異，可將這些分離菌劃分為強毒力、低毒力菌株[3-5]。強毒力菌株包括序列型為ST121和ST3320的分離菌，能在兔群中快速傳播，引起所有日齡兔的致死性呼吸道感染，在短期內能導致大量感染兔的死亡，造成嚴重的經濟損失[3,5]。低毒力菌株則是序列型為ST398的分離菌，在兔群中呈點狀慢速擴散，引起慢性化膿性感染，如乳房炎、腳皮炎以及組織和器官膿腫等，感染兔病程長，最終以機體極度消瘦而死亡[4]。由此可見，與低毒力菌株相比，強毒力金黃色葡萄球菌對兔產業的危害更為嚴重。因此，建立一種快速、特異性強且敏感性高的檢測方法以及時、準確地掌握兔源強毒力金黃色葡萄球菌在兔群中的流行情況，對保障兔產業的發展具有重要意義。

目前，用于兔源強毒力金黃色葡萄球菌的檢測方法有細菌分離鑒定[3-5]、雙重PCR方法[6]和環介導等溫擴增方法[7]，尚未見熒光定量PCR方法的報道。本試驗根據兔源強毒力金黃色葡萄球菌為pvl基因陽性而低毒力菌株為pvl基因陰性的特點[3-5]，針對pvl基因設計特異性的引物和探針，建立檢測兔源強毒力金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR方法，進一步豐富兔源強毒力金黃色葡萄球菌的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株供試菌株包括兔源強毒力和低毒力金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、魏氏梭菌(Clostridieumwelchii,C.welchii)和大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)均由本實驗室分離保存，所有供試菌株均用腦心浸出液培養基培養。

1.2 主要試劑和儀器細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、2×Probe qPCR SuperMix和pEASY-T1載體購自北京全式金生物技術股份有限公司；Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀購自Eppendorf公司。

1.3 引物和探針的設計根據本實驗室分離鑒定的兔源強毒力金黃色葡萄球菌的pvl基因序列，以及該基因在NCBI數據庫中的BLAST分析結果，應用Oligo軟件設計了針對該基因保守序列的引物和探針。引物序列為pvl-F:5′-atacaaagccaaatccaaa-3′/pvl-R:5′-gtgcataatctacaacgttt-3′，探針序列為pvl-P:5′-atgttgtacttagaaccccaa-3′，探針的5′端和3′端分別標記熒光報告基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1。目的基因的預期擴增長度為114 bp。引物由上海鉑尚生物技術有限公司合成。

1.4 熒光定量PCR方法的初步建立及擴增產物的鑒定以兔源強毒力金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR擴增。熒光定量PCR反應體系：2×Probe qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.4 μL，基因組DNA 1 μL，滅菌雙蒸水7.8 μL，共20 μL。反應程序：94℃ 5 min，40個循環(94℃ 5 s，60℃ 30 s)，在每個循環的退火延伸階段收集熒光信號。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收并測序，測序結果與參考基因進行BLAST比對分析，確定引物和探針的特異性。

1.5 熒光定量PCR檢測方法反應條件的優化在探針終濃度為0.2 μmol/L、退火延伸溫度為60℃條件下，將引物終濃度設置為0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 μmol/L進行熒光定量PCR擴增，確定最佳引物濃度；在最佳引物濃度和退火延伸溫度為60℃條件下，將探針終濃度設置為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 μmol/L 進行熒光定量PCR擴增，確定最佳探針濃度。在最佳引物和探針濃度條件下，將退火延伸溫度設置為55.1～65.8℃進行梯度擴增，確定最佳退火延伸溫度。

1.6 熒光定量PCR檢測方法的特異性以兔源強毒力和低毒力金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大腸桿菌的基因組DNA為模板，應用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，以滅菌ddH2O為陰性對照，評估該方法的特異性。

1.7 熒光定量PCR檢測方法的敏感性和標準曲線的建立以兔源強毒力金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，應用本試驗設計的pvl基因上、下游引物進行普通PCR擴增，將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化回收，克隆到pEASY-T1，轉化DH5α感受態細胞，得到重組質粒pEASY-T1-pvl。根據重組質粒pEASY-T1-pvl的濃度，計算其拷貝數，以該重組質粒為模板，并將其在反應體系中的終濃度設置為1×108～1×100拷貝/μL，應用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，以滅菌ddH2O為陰性對照，評估該方法的敏感性并繪制標準曲線。

1.8 熒光定量PCR檢測方法的重復性將pEASY-T1-pvl重組質粒在反應體系中的終濃度設置為1×108～1×106拷貝/μL，應用建立的熒光定量PCR方法進行同一批次和不同批次的檢測，每次檢測時每份樣品重復3次，計算批內和批間的變異系數(CV)，評估該方法的重復性。

1.9 熒光定量PCR檢測方法的初步應用選取從福建省不同地區采集的126份已知結果的呼吸道病死兔肺臟樣品，其中包括強毒力金黃色葡萄球菌陽性樣品13份(ST121型菌株和ST3320型菌株陽性樣品分別為6，7份)、低毒力金黃色葡萄球菌樣品27份、多殺性巴氏桿菌陽性樣品43份(A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品分別為15，15，13份)、支氣管敗血波氏桿菌陽性樣品15份、肺炎克雷伯菌陽性樣品14份和大腸桿菌陽性樣品14份。分別提取這些樣品的基因組DNA，應用本試驗建立的熒光定量PCR方法和已報道的雙重PCR方法[6]及環介導等溫擴增方法[7]同時進行檢測，對比該方法與已知結果、雙重PCR方法和環介導等溫擴增方法的檢測結果，評估該熒光定量PCR方法的臨床實用性。

2 結果

2.1 熒光定量PCR方法的初步建立及擴增產物的鑒定結果顯示，該方法對兔源強毒力金黃色葡萄球菌的基因組DNA有明顯的擴增曲線，對陰性對照(滅菌ddH2O)則無擴增曲線(圖1A)。將熒光定量PCR的擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，結果顯示，該方法從兔源強毒力金黃色葡萄球菌的基因組DNA中擴增到長度為114 bp的條帶(圖1B)，與預期的目的條帶相符。將該片段回收后測序，測序結果表明該片段的序列與參考基因的序列完全一致。

M.DL5000 DNA Marker;1.兔源強毒力金黃色葡萄球菌;2.陰性對照

2.2 熒光定量PCR檢測方法反應條件的優化在探針終濃度為0.2 μmol/L和退火延伸溫度為60℃條件下，當引物的終濃度為0.6 μmol/L時，熒光定量PCR的擴增效果最優(圖2)。在引物濃度為0.6 μmol/L和退火延伸溫度為60℃條件下，當探針的終濃度為0.3 μmol/L時，熒光定量PCR的擴增效果最優(圖3)。在引物和探針濃度分別為0.6，0.3 μmol/L 條件下，當退火延伸溫度為59.8℃時，熒光定量PCR的擴增效果最優(圖4)。因此，確定該熒光定量PCR方法的最佳反應條件為引物和探針終濃度分別為0.6，0.3 μmol/L，退火延伸溫度為59.8℃。

圖2 熒光定量PCR方法引物濃度的優化

圖3 熒光定量PCR方法探針濃度的優化

圖4 熒光定量PCR方法退火延伸溫度的優化

2.3 熒光定量PCR檢測方法的特異性結果顯示，該方法僅對兔源強毒力金黃色葡萄球菌的基因組DNA有擴增曲線，對其他兔源病原菌，包括兔源低毒力金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大腸桿菌的基因組DNA和陰性對照均無擴增曲線(圖5)，表明該方法特異性良好。

1.兔源強毒力金黃色葡萄球菌;2～8.兔源低毒力金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌、大腸桿菌和陰性對照

2.4 熒光定量PCR檢測方法的敏感性和標準曲線的建立結果顯示，該方法的最低檢測限為10 拷貝/μL(圖6)。該方法的標準曲線方程為y=-3.259x+43.81，CV為0.995，擴增效率為103%(圖7)，表明該方法反應體系中模板濃度(x軸)與Ct值(y軸)之間具有良好的線性關系，且擴增效率較高。

1～9.1×108～1×100 拷貝/μL的pEASY-T1-pvl重組質粒模板;10.陰性對照

圖7 熒光定量PCR方法的標準曲線

2.5 熒光定量PCR檢測方法的重復性結果顯示，批內和批間重復性試驗的CV均小于2%(表1)，表明該方法重復性好。

表1 熒光定量PCR方法的重復性試驗

2.6 熒光定量PCR檢測方法的初步應用結果顯示，熒光定量PCR方法檢測到兔源強毒力金黃色葡萄球菌陽性樣品13份，陰性樣品113份，該結果與已知結果、雙重PCR方法和環介導等溫擴增方法的檢測結果完全一致，表明該熒光定量PCR方法準確性好，具有很好的臨床實用性。

3 討論

兔葡萄球菌病廣泛流行于世界各地的兔群中，是危害兔產業發展的重要疫病之一[8]。前期有研究表明，該病的病原金黃色葡萄球菌包含兩種毒力差異較大的菌株，強毒力菌株引起急性的致死性呼吸道感染，而低毒力菌株則引起組織器官的慢性化膿性感染[3-5]。由此可見，強毒力菌株的流行能造成兔產業的嚴重經濟損失，實現對該菌快速且準確地檢測，對保障兔產業的發展具有重要意義。

熒光定量PCR是重要的病原快速檢測方法之一，已被廣泛應用于各種病原菌的快速檢測，如大腸桿菌、沙門菌和多殺性巴氏桿菌等[9-10]。本試驗以兔源強毒力金黃色葡萄球菌的pvl基因(低毒力菌株為pvl基因陰性)為目的基因，建立了檢測兔源強毒力金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR方法。pvl基因編碼的殺白細胞毒素經受體介導能在白細胞的細胞膜上形成穿孔而導致白細胞凋亡[11]，由于攜帶該基因的金黃色葡萄球菌都具有很強的致病性，因此該基因也成為強毒力金黃色葡萄球菌的重要標記[12-14]。由此可見，本試驗以pvl基因為靶基因建立檢測兔源強毒力金黃色葡萄球菌的熒光定量PCR方法是可行的。

本試驗建立的熒光定量PCR方法特異性強，僅對兔源強毒力金黃色葡萄球菌的基因組DNA有擴增，而對常見的兔源病原菌(兔源低毒力金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、魏氏梭菌和大腸桿菌)的基因組DNA的擴增結果均為陰性。本試驗建立的熒光定量PCR方法速度快，僅需約50 min就能完成檢測，比已報道的用于檢測兔源強毒力金黃色葡萄球菌的雙重PCR方法[6](約需1.5 h)和環介導等溫擴增方法[7](約需1 h)的耗時都短，能有效地提高檢測效率。此外，本試驗建立的熒光定量PCR方法的最低檢測限可達到1×101拷貝/μL，比已報道的雙重PCR方法[6-7](最低檢測限為1×104拷貝/μL)和環介導等溫擴增方法[7](最低檢測限為1×102拷貝/μL)的最低檢測限分別高1 000倍和10倍，適用于病原菌含量低的樣品檢測。由此可見，本試驗建立的熒光定量PCR方法不僅豐富了現有的兔源強毒力金黃色葡萄球菌檢測方法，也為兔源強毒力金黃色葡萄球菌的快速檢測提供了技術支持。