酵母雙雜交篩選與牛病毒性腹瀉病毒NS4B互作的宿主蛋白

丁 媛，石金鳳，韓子琪，刁乃超，鄧賀文，李健明,3,4，時 坤,3,4*，杜 銳,3,4,5*

(1.吉林農業(yè)大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業(yè)大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；3.梅花鹿藥用資源利用關鍵技術研究室，吉林 長春130118；4.吉林省梅花鹿高效養(yǎng)殖和產品開發(fā)技術工程研究中心，吉林 長春 130118；5.動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)隸屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，已在全球88個國家中檢測到該病原體。BVDV感染后發(fā)病機制復雜，可導致生長遲緩、生殖功能和免疫功能障礙、并發(fā)感染和持續(xù)性感染(persistent infection，PI)等，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經濟損失。BVDV遺傳和抗原多樣性可能導致診斷和免疫失敗[1]，使該病毒的防控變得復雜且具有挑戰(zhàn)性。了解BVDV與宿主蛋白的相互作用有助于進一步探究BVDV感染和發(fā)病機理，從而開發(fā)新的治療方法和免疫策略。

在病毒復制過程中，RNA的合成是由復制復合物(replication complex，RC)介導的。RC由病毒和宿主細胞蛋白組成，其是在內質網膜形成的囊泡中進行組裝的膜結合多蛋白。NS4B是黃病毒RC的核心，在調節(jié)病毒毒力和先天免疫反應中發(fā)揮作用[2]。NS4B也是BVDV復制酶的重要組成部分，與丙型肝炎病毒(HCV) NS4B在免疫原性上具有相似的遺傳特征[3-4]。眾所周知，BVDV可通過逃避宿主固有免疫系統(tǒng)引起持續(xù)感染，研究發(fā)現(xiàn)BVDV NS4B可通過抑制MDA5介導的信號轉導通路，發(fā)揮干擾素-β拮抗劑的作用，從而促進BVDV的增殖[5]。另一研究發(fā)現(xiàn)單獨的NS4B可誘導自噬體，從而在BVDV復制中發(fā)揮重要功能[6]。因此，本試驗以BVDV NS4B為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交技術，從MDBK-cDNA文庫中篩選相互作用的宿主蛋白，為進一步了解NS4B蛋白功能以及探究BVDV致病機制提供新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料MDBK-cDNA文庫、BVDV NADL株、MDBK細胞、質粒pGADT7-Rec、pGBKT7、pGADT7-T、pGADT7-Lam、pGBKT7-53、Yeastmaker Carrier DNA等由吉林省梅花鹿高效養(yǎng)殖和產品開發(fā)技術工程研究中心保存；Y187 Yeast Strain(630457)、Y2H Gold Yeast Strain(630498)、Matchmaker Gold酵母雙雜交系統(tǒng)(630489)、酵母雙雜交培養(yǎng)基(630494)和c-Myc單克隆鼠源抗體(631206)購自Clontech生物公司；RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA Marker、核酸染料、常規(guī)限制性酶和EmeraldAmp?PCR Master Mix(RR300A)均購自TaKaRa公司；Seamless Assembly Cloning Kit購自中美泰和生物公司；Axygen質粒提取試劑盒購自Axygen公司。

1.2 BVDV NS4B基因的擴增根據(jù)GenBank中登錄的BVDV NS4B基因序列，利用Primer 5.0軟件設計引物，上游引物：5′-GAATTCCCGGGG-ATCCCCTAAGAAAAAGCGCAAAGTTGCGTC-GGGTG ACGTGGAAAAAATC-3′，下游引物：5′-TAGTTATGCGGCCGCTGCAGCAGGTTCCTTATTTTCCCTTGTGAG-3′，其中下劃線部分表示酶切位點，斜體部分為PKKKRKV核定位信號。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。以BVDV NADL 株cDNA為模板，PCR擴增NS4B基因序列。反應體系：PrimeSTAR Max premix 25 μL，cDNA 0.3 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 補齊至50 μL。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，測序鑒定正確后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 誘餌質粒pGBKT7-NS4B的構建使用限制性內切酶BamHⅠ和PstⅠ分別酶切pGBKT7載體，利用Seamless Assembly Cloning Kit對純化后的PCR產物和載體進行連接轉化，提取質粒，酶切鑒定后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 誘餌蛋白NS4B表達的鑒定制備Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞，將誘餌質粒pGBKT7-NS4B和空載體pGBKT7分別轉化至酵母感受態(tài)細胞中。轉化菌液經倍比稀釋后涂于SD/-Trp固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d。對陽性克隆菌落進行PCR鑒定和測序分析，提取酵母細胞總蛋白，Western blot檢測BVDV NS4B蛋白的表達情況。

1.5 誘餌蛋白自激活和毒性檢測將Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp、SD/-Trp/-Leu(DDO)固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長情況，判斷誘餌蛋白NS4B是否具有自激活活性。將Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]和Y2H Gold[pGBKT7]菌液分別涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況，判斷誘餌蛋白NS4B對酵母細胞是否存在毒性作用。

1.6 BVDV NS4B互作宿主蛋白篩選將4 mL酵母菌Y2H Gold-NS4B菌液和1 mL MDBK-cDNA文庫接到45 mL 2×YPDA(50 mg/L Kan+)中，30℃低速培養(yǎng)20 h；將菌液室溫1 000×g離心10 min棄上清，用10 mL 0.5×YPDA重懸菌體，涂布于QDO/X固體培養(yǎng)基上；同時也將Y2H Gold[pGBKT7-Lam]和Y187[pGADT7-T](陰性對照)、Y2H Gold[pGBKT7-53]和Y187[pGADT7-T](陽性對照)菌液涂布于QDO/X固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3～5 d；挑取藍色單菌落進行PCR擴增、質粒抽提和測序。

1.7 BVDV NS4B互作宿主蛋白回返驗證從互作蛋白中隨機選擇9個蛋白，分別設計引物(表1)進行PCR擴增并連接在pGADT7-Rec載體(將其簡稱為AD)上，然后將以上AD重組載體分別與pGBKT7-NS4B共轉化到Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞中，同時將上述重組質粒與pGBKT7共轉做陰性對照組，雜交液倍數(shù)稀釋后涂在SD/-Trp、SD/-Leu、DDO和QDO/X固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d 后，觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況；根據(jù)QDO/X固體培養(yǎng)基上是否生長藍色菌落來判定NS4B蛋白分別與AKIP1、LY6E、RABAC1、RPS20、SYNGR2、TIMM17B、LGALS1、RPL31、D18.3蛋白是否存在互作關系。

表1 引物信息

1.8 免疫共沉淀驗證蛋白的相互作用構建重組質粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-RABAC1、pcDNA3.1(+)-3×Flag-SYNGR2、pcDNA3.1(+)-3×Flag-D18.3，同時構建重組質粒pcDNA3.1(+)-HA-NS4B，用BamHⅠ和XhoⅠ對上述重組質粒進行酶切鑒定，構建重組質粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-AKIP1，并用EcoRⅠ和XhoⅠ進行酶切鑒定和測序。分別將構建成功的重組質粒與pcDNA3.1(+)-HA-NS4B共轉染至HEK293T細胞，轉染48 h后用Lysis/Equilibration Buffer提取細胞總蛋白，取50 μL作為input，加入Rabbit Anti-HA抗體室溫孵育20 min；Wash Buffer洗滌，加入Neutralization Buffer中和，用Elution Buffer洗脫蛋白，加入蛋白上樣緩沖液煮沸5～10 min，Western blot檢測蛋白互作情況。

2 結果

2.1 構建誘餌質粒pGBKT7-NS4B以BVDV NADL株cDNA為模板，PCR擴增NS4B基因片段，獲得目的片段大小約為1 062 bp的片段(圖1)，符合預期大小。經純化、酶切和連接后轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，挑取單克隆，提取質粒經BamHⅠ和PstⅠ酶切鑒定，分別獲得大小約為7 300，1 062 bp的目的片段(圖1)，符合預期大小。送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序比對，構建誘餌質粒命名為pGBKT7-NS4B。

M.DL15000 DNA Marker；1～4.誘餌質粒pGBKT7-NS4B的雙酶切產物

2.2 誘餌蛋白NS4B在酵母菌中的表達情況培養(yǎng)并收集重組酵母菌Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]，提取酵母菌體蛋白，Western blot檢測誘餌蛋白NS4B的表達，結果NS4B可在酵母菌中表達，蛋白大小約為40 kDa(圖2)，對照組Y2H Gold[pGBKT7]菌液未見該蛋白條帶，表明誘餌蛋白NS4B可在酵母菌中正確表達。

1.對照質粒pGBKT7；2.誘餌質粒pGBKT7-NS4B

2.3 誘餌質粒pGBKT7-NS4B自激活和毒性檢測Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]重組菌液在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上有菌落生長(圖3A)，在DDO固體培養(yǎng)基上無菌落生長(圖3B)，表明誘餌蛋白NS4B無自激活能力。Y2H Gold[pGBKT7-NS4B](圖4A)與Y2H Gold[pGBKT7]對照組菌液(圖4B)在SD/-Trp培養(yǎng)基上的菌落生長速度及大小無明顯差別，表明誘餌蛋白NS4B對酵母細胞無毒性作用，可進行后續(xù)試驗。

A.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp培養(yǎng)基；B.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于DDO培養(yǎng)基

A.Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]菌液涂于SD/-Trp培養(yǎng)基；B.Y2H Gold[pGBKT7]菌液涂于SD/-Trp培養(yǎng)基

2.4 酵母雙雜交陽性克隆的篩選結果Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]與MDBK-cDNA文庫菌液雜交后，可觀察到雜交液在QDO/X固體培養(yǎng)基上有藍色單菌落生長，將藍色單菌落重新轉移到新的QDO/X固體培養(yǎng)基上進行復驗，復驗結果與初篩結果一致(圖5)。

圖5 在QDO/X培養(yǎng)基上篩選藍色克隆菌落的結果

2.5 BVDV NS4B互作蛋白的篩選結果提取QDO/X固體培養(yǎng)基上陽性菌落的質粒，以質粒為模板，NS4B為引物進行PCR擴增，擴增產物直接進行純化、回收、測序，測序序列經BLAST比對分析，去除相同序列的陽性克隆，初步獲得14個與NS4B相互作用的候選宿主蛋白(表2)。

表2 與NS4B相互作用的蛋白篩選結果

2.6 部分互作蛋白的回復雜交試驗結果對9種互作蛋白進行了酵母回復雜交試驗，雜交液涂布在QDO/X固體培養(yǎng)基上，均出現(xiàn)藍色單菌落(圖6A2～I2)，表明這9種蛋白TIMM17B、LGALS1、LY6E、SYNGR2、RPL31、RABAC1、D18.3、AKIP1、RPS20均與NS4B蛋白互作。

2.7 免疫共沉淀結果將構建成功的重組質粒pcDNA3.1(+)-3×Flag-RABAC1、pcDNA3.1(+)-3×Flag-SYNGR2、pcDNA3.1(+)-3×Flag-D18.3和 pcDNA3.1(+)-3×Flag-AKIP1分別與 pcDNA3.1(+)-HA-NS4B分別共轉染至HEK293T細胞，轉染后48 h裂解細胞，進行免疫共沉淀試驗。結果表明，NS4B僅與SYNGR2(圖7A)、RABACI(圖7B)發(fā)生了相互作用。

3 討論

1989年，有報道首次提出酵母雙雜交技術，通過重組轉錄因子GAL4報告基因的激活檢測蛋白質間是否存在相互作用[7]。GAL4由DNA結合結構域(DNA binding domain，BD)和轉錄激活結構域(activation domain，AD)構成[8]。該技術操作簡單、體系成熟、成本較低，可有效檢測二元蛋白的相互作用。此外，該方法是在胞內進行反應測定，可避免細胞裂解對反應的影響，該技術已廣泛用于蛋白互作研究。ZHANG等[9]利用酵母雙雜交技術檢測出經典豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)NS4B與豬RING指蛋白114(pRNF114)C端結構域存在相互作用，并指出該相互作用可抑制CSFV復制，從而闡明了pRNF114對CSFV的抗病毒機制。QIAN等[10]也使用該技術篩選出CSFV NS4B的互作蛋白FHC，并指出NS4B可能通過與FHC互作影響病毒的復制過程。吳濤等[11]以豬鏈球菌2型(SS2)透明質酸酶(HYL)作為誘餌蛋白,利用CytoTrap酵母雙雜交系統(tǒng),從人的肺臟組織cDNA文庫中篩選與HYL相互作用的蛋白,探索出HYL在SS2致病中的作用。鄭博偉等[12]利用酵母雙雜交技術篩選出與E種腸道病毒HY12毒株編碼VPI蛋白的宿主互作蛋白，為研究牛腸道病毒感染機制及病毒結構蛋白VPI的功能奠定了基礎。關于BVDV NS4B互作蛋白的研究較少，因此，本試驗將BVDV NS4B蛋白融合到BD載體上，構建了重組質粒pGBKT7-NS4B，與實驗室前期制備的MDBK-cDNA文庫，進行了酵母雙雜交試驗。

在試驗前期需要確定誘餌蛋白NS4B是否具有自激活活性和對酵母細胞是否有毒性作用。若誘餌蛋白具有自激活活性，則無需與宿主蛋白結合便可直接激活UAS下游基因進行轉錄，造成假陽性結果。雜交試驗是在胞內進行的，若誘餌蛋白對酵母細胞具有毒性作用，則會出現(xiàn)假陰性結果。因此，將誘餌質粒pGBKT7-NS4B轉化到Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞中，轉化液分別涂于SD/-Trp、DDO固體培養(yǎng)基上來驗證誘餌蛋白NS4B無自激活活性。利用酵母Y2H Gold菌株在氨基酸(Trp、His、Leu或Ade)缺失培養(yǎng)基上無法生長，但BD和AD載體上帶有Trp、Leu轉化標記，可分別在SD/-Trp、SD/-Leu培養(yǎng)基上生長的特性，將Y2H Gold[pGBKT7-NS4B]與Y2H Gold[pGBKT7]菌液涂于氨基酸缺失培養(yǎng)基上來驗證誘餌蛋白NS4B對酵母細胞無毒性作用。

A1.BD+AD-TIMM17B；A2.BD-NS4B+AD-TIMM17B；B1.BD+AD-LGALS1；B2.BD-NS4B+AD-LGALS1；C1.BD+AD-LY6E； C2.BD-NS4B+AD-LY6E；D1.BD+AD-SYNGR2；D2.BD-NS4B+AD-SYNGR2；E1.BD+AD-RPL31；E2.BD-NS4B+AD-RPL31；F1.BD+AD-RABAC1；F2.BD-NS4B+AD-RABAC1；G1.BD+AD-D18.3；G2.BD-NS4B+AD-D18.3；H1.BD+AD-AKIP1；H2.BD-NS4B+AD-AKIP1；I1.BD+AD-RPS20；I2.BD-NS4B+AD-RPS20

采用Y2H系統(tǒng)初步篩選出14種與BVDV NS4B互作的宿主蛋白，均對細胞具有調控作用，參與調節(jié)宿主能量代謝、細胞增殖和凋亡等過程，或與病毒感染、復制和免疫逃逸有關。研究表明，GAPDH[13-14]、LY6E[15-17]、RABACI[18-19]、SYNGR2[20-21]、LGALS1[22-24]、RPL31[25]和RPS20[26]蛋白均可與某些病毒蛋白發(fā)生相互作用，從而參與病毒的感染和復制過程。AKIP1[27]、TIMM17B[28]、ENTPD6、FAM96B、FLNA[29- 30]、IL-17RA[31-32]、D18.3蛋白參與了細胞凋亡、細胞增殖與分化、免疫反應和遺傳疾病等過程，但在病毒學中的功能仍不明確。通過免疫共沉淀進一步明確NS4B與SYNGR2、RABACI發(fā)生了相互作用。先前的研究表明，SYNGR2基因突變會影響豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)病毒的復制能力，SYNGR2被特異性siRNA沉默時，PK15細胞中的PCV2滴度會出現(xiàn)降低[32]。此外，SYNGR2還可能在受監(jiān)管的外泌體中發(fā)揮作用，調節(jié)囊泡的形成和成熟。RABACI也是一種高爾基復合體囊泡形成所需的蛋白調節(jié)劑，控制囊泡間對接和融合。RABACI可與酵母雙雜交系統(tǒng)中的多種異戊二烯化Rabs相互作用，有研究表明，可以通過抑制異戊烯化作用來減弱HCV的復制[32]。

A1，A2.正、反向Co-IP驗證NS4B與SYNGR2的相互作用；B1，B2.正、反向Co-IP驗證NS4B與RABAC1的相互作用；C1，C2.正、反向Co-IP驗證NS4B與AKIP1的相互作用；D1，D2.正、反向Co-IP驗證NS4B與MHC-Ⅰ類分子的相互作用

本試驗利用酵母雙雜交技術篩選出14種與BVDV NS4B互作的宿主蛋白，通過回返試驗、正反向Co-IP試驗表明BVDV NS4B與SYNGR2、RABACI存在相互作用。為探究BVDV NS4B蛋白在BVDV感染和復制過程中的作用提供了理論依據(jù)。