華南地區(qū)牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒全基因組測序及分析

周秀蓉，黃敏霞，徐志宏，溫肖會，羅勝軍，賈春玲，高 原，翟 頎*，呂殿紅*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 動物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心，廣東 廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 動物科技學院，廣東 廣州 510225;3.珠海市啟信達生物科技有限公司，廣東 珠海 519000)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy skin disease,LSD)是一種對養(yǎng)牛業(yè)具有重大經(jīng)濟意義的動物傳染病，其病原體是牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)，屬于痘病毒科(Poxviridae)，脊索痘病毒亞科(Chordopoxvirinae,ChPV)[1]。與山羊痘病毒(goatpox virus,GTPV)和綿羊痘病毒(sheeppox virus,SPPV)一同歸屬山羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV)。最近LSD頻繁暴發(fā)于東亞和南亞國家，包括孟加拉國、中國、印度、尼泊爾[2]、不丹、越南、緬甸、斯里蘭卡、泰國[3]、馬來西亞、柬埔寨和老撾等[4]。

2019年我國與印度、孟加拉國幾乎同一時期暴發(fā)LSD。其中孟加拉國最先于2019年7月暴發(fā)LSD，印度首次發(fā)生LSD是在2019年8月東部地區(qū)[5-6]。我國首例LSD疫情暴發(fā)于2019年8月鄰近哈薩克斯坦的新疆伊犁州，張敏敏等[7]從患病動物身上采集皮膚組織樣本分離出LSDV/China/Xinjiang/2019，并得到其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)與2017年俄羅斯LSDV/Russia/Saratov/2017高度同源，推測我國LSD疫情為鄰國傳入，但是該毒株具有在LSDV/Russia/Saratov/2017中未觀察到的新進化特征，我國LSD暴發(fā)的LSDV分離株的真正來源仍需進一步調(diào)查。此后間隔了將近9個月，于2020年6月傳播到華南地區(qū)，我國多個省份開始密集發(fā)生了多起LSD疫情，至今已波及了十幾個省份[4,8]。期間，越南也在2020 年 11 月 1 日向 OIE 首次報告LSD疫情[9]。MA等[10]獲得了2020年我國廣東的1株LSDV分離株(China/GD01/2020)全基因組序列，確定其為1株田間強毒與疫苗的重組毒株，并根據(jù)GPCR和PRO30基因遺傳進化樹推測可能與新疆LSD疫情有共同來源。China/GD01/2020是目前鑒定的第3株LSDV重組毒株，另外2株重組毒株是俄羅斯的LSDV/Russia/Saratov/2017和LSDV/Russia/Udmurtiya/2019[11-12]。但我國2020年發(fā)生的其他幾起LSD疫情來源尚未知，與2019年新疆LSD疫情來源是否一致仍然不確定，同時LSDV基因組有高度保守性和遺傳穩(wěn)定性，必須對整個基因組進行分析和監(jiān)測，以進一步發(fā)現(xiàn)LSDV的遺傳變化特征，掌控國內(nèi)LSD疫情的傳入源頭和流行趨勢，更加精準地防控LSDV。

本研究自2020年6月我國廣東省潮州市和2020年10月廣西壯族自治區(qū)百色市公布LSDV疫情的牛群中分別采集到疑似LSDV感染的牛皮膚組織樣品，經(jīng)qPCR檢測和透射電鏡鑒定后，使用高通量測序技術(shù)對2份樣品進行全基因組測序、序列比較、遺傳進化分析和重組事件分析研究，以期為國內(nèi)疫情溯源提供線索，為國內(nèi)LSDV的防控策略制定提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理疑似LSDV感染的牛皮膚組織樣品分別采自我國廣東省潮州市和廣西壯族自治區(qū)百色市公布LSD疫情的牛群。取部分疑似LSDV感染的牛皮膚組織樣品向其中加入適量無菌生理鹽水勻漿混懸，制成約10% 組織勻漿，8 000×g離心2 min 后棄沉淀，取上清液用0.45 μm過濾器過濾，收集濾液用于后續(xù)試驗。

1.2 主要試劑羊痘病毒、LSDV核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒購自鄭州中道生物技術(shù)有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master mix(KT201)和50×TAE核酸電泳緩沖液購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；核酸凝膠產(chǎn)物回收試劑盒購自 Axygen 生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器冷凍高速離心機購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；BIO-RAD T100 梯度PCR儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；qTOWER3熒光定量PCR儀購自德國耶拿分析儀器股份有限公司；HT7700透射電子顯微鏡購自日立高新技術(shù)公司。

1.4 樣品檢測將上述樣品濾液進行滅活后提取病毒總DNA，利用羊痘病毒、LSDV核酸雙重熒光PCR檢測試劑盒進行檢測，陽性對照和陰性對照均為試劑盒提供，同時設(shè)山羊痘疫苗為對照組。

1.5 病毒電鏡鑒定將新鮮制備的組織濾液緩慢滴加到400目銅網(wǎng)上，25℃吸附銅網(wǎng)1 min，轉(zhuǎn)移到1滴Tris-EDTA 緩沖液(pH 7.8) 中20 s，2% 磷鎢酸染液(pH 7.2)負染10 s后，用濾紙吸掉多余的磷鎢酸，自然干燥后，透射電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)，觀察后將電鏡讀片進行高壓滅菌處理。

1.6 全基因組測序?qū)?.1保存的樣品濾液滅活后，重新提取其中病毒基因組DNA送廣州和沁生物科技有限公司進行Illumina高通量測序。

1.7 基因組組裝、注釋和序列比較用在線BLAST工具進行驗證并篩選組裝序列(scaffolds)，參考毒株20L81_Bang-Thanh/VNM/20(MZ577-076)的全基因組序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物以擴增不同scaffolds間隔區(qū)序列(表1)，分別以2株病毒總DNA為模板進行PCR擴增，膠回收后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，最后利用重疊序列拼接scaffolds，進一步組裝分離株全基因組序列。使用GATU軟件(https://4virology.net/virology-ca-tools/gatu/)參照China/GD01/2020(MW355944)的全基因組序列對分離株基因組進行編碼基因功能注釋。使用EditSeq軟件、SnapGene 3.1.1軟件和MegAlign軟件進行分離株全基因組序列之間比較分析。

1.8 病毒全基因組進化分析使用在線BLAST工具與GenBank數(shù)據(jù)庫中的全基因組序列進行比對，下載所有可用的LSDV全基因組序列，以及部分GTPV和SPPV全基因組序列，使用MAFFT在線工具(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)進行全基因組比對，并利用鄰近法構(gòu)建遺傳進化樹，設(shè)置bootstrap值為1 000。

表1 拼接基因序列的特異性引物

1.9 病毒重組分析參照GenBank數(shù)據(jù)庫中可用的LSDV全基因組序列和我國推薦使用的GTPV-AV41疫苗株，與GD02和GX01構(gòu)成比對，使用RDP 4.100軟件中的RDP、Bootscan、MaxChi、GENECONV、Chimaera和 3Seq方法進行分析，識別基因組內(nèi)潛在的重組事件。

2 結(jié)果

2.1 樣品檢測結(jié)果根據(jù)樣品核酸檢測結(jié)果(圖1A、B)，判定為LSDV陽性，陰、陽性及對照均正常。

1.待檢廣東潮州核酸樣品；2.待檢廣西百色核酸樣品；3.GTPV疫苗核酸樣品；4.陽性對照

2.2 病毒電鏡鑒定經(jīng)透射電鏡觀察，病毒粒子呈卵圓形或磚形，廣東潮州樣品病毒粒子平均大小為300 nm×283 nm，廣西百色樣品病毒粒子平均大小為267 nm×233 nm，2份樣品的病毒粒子符合LSDV的細胞內(nèi)成熟病毒(intracellular mature virus，IMV)(圖2A、C)和LSDV細胞外包膜病毒(extracellular enveloped virus，EEV)(圖2B、D)的外觀和大小。

A.放大3萬倍的廣東潮州樣品病毒粒子；B.放大3萬倍的廣東潮州樣品病毒粒子;C.放大1.5萬倍的廣西百色樣品病毒粒子；D.放大4萬倍的廣西百色樣品病毒粒子

2.3 測序數(shù)據(jù)組裝和注釋對高通量測序數(shù)據(jù)進行比對篩選后，設(shè)計引物進行間隔序列的PCR擴增(圖3)，測序后利用重疊序列組裝拼接scaffolds，獲得了2個大小分別為150 160，150 665 bp的全基因組連續(xù)序列，并將其分別正式命名為China/GD02/2020株(以下簡稱為GD02)和China/GX01/2020株(以下簡稱為GX01)。以China/GD01/2020 (MW355944)為參考基因組，利用GATU軟件對其分別進行開放閱讀框(open reading frame，ORF)功能注釋，GD02分離株有149個ORF，GX01分離株有147個ORF，將注釋后的GD02和GX01全基因組序列上傳GenBank數(shù)據(jù)庫后分別獲得登錄號為OM803091和OM803092。

M.DL2000 DNA Marker；1.GD-1引物的PCR擴增產(chǎn)物；2.GD-2引物的PCR擴增產(chǎn)物；3.GD-3引物的PCR擴增產(chǎn)物；4.GD-4引物的PCR擴增產(chǎn)物；5.陰性對照；6.GX-1引物的PCR擴增產(chǎn)物；7.GX-2引物的PCR擴增產(chǎn)物；8.GX-3引物的PCR擴增產(chǎn)物；9.GX-4引物的PCR擴增產(chǎn)物；10.GX-5引物的PCR擴增產(chǎn)物

2.4 基因組序列間比較經(jīng)BLAST工具比對分析，發(fā)現(xiàn)GD02分離株和GX01分離株有99.99%的相似性，其中GX01分離株包含GD02分離株所有的基因序列，存在3處差異，主要在基因組兩端(圖4)。與參考基因組GD01株序列進行比較分析，GD02株和GX01株在基因組的5′端非編碼區(qū)有25個核苷酸(nt)缺失，GD02額外缺失15 nt；在基因組3′端非編碼區(qū)插入46 nt，GX01額外插入39 nt。在基因組中間編碼區(qū)域有4個基因發(fā)生堿基突變和3處片段發(fā)生堿基缺失。其中ORF001和ORF103分別發(fā)生1個氨基酸替換，ORF071發(fā)生同義氨基酸突變，ORF155有2 nt突變，導致1個氨基酸替換，且翻譯提前終止。編碼Kelch 樣蛋白的ORF144發(fā)生1 nt 缺失造成移碼突變，1個氨基酸被替換，產(chǎn)生截短蛋白；另外在ORF143和ORF144之間的編碼基因間隔區(qū)有1 nt缺失，ORF154和ORF155之間的編碼基因間隔區(qū)有7 nt突變。GD02在中間編碼區(qū)域沒有發(fā)生堿基插入，GX01在1個未注釋ORF(ORF22和ORF24之間)發(fā)生插入T，導致組氨酸替換5號氨基酸位點的亮氨酸，以及絲氨酸替換8號位點的纈氨酸，且使得翻譯提前終止于該位置，中斷了1個大小為219 bp 的ORF讀取(表2)。

圖4 GD02與GX01的基因組序列差異

表2 GD02分離株與GX01分離株的核苷酸序列改變及對編碼序列的影響

2.5 全基因組遺傳進化分析在GenBank數(shù)據(jù)庫下載43株可用的LSDV全基因組序列信息，同時下載3株SPPV毒株和4株GTPV毒株，包括國內(nèi)廣泛使用的山羊痘弱毒疫苗GTPV_AV41毒株。由遺傳進化分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，CaPV毒株之間同源性很高，超過97%，LSDV毒株與GTPV毒株較SPPV毒株的親緣性更近，LSDV毒株可以大致分為三大分支，14株疫苗株或疫苗樣毒株(vaccine/vaccine-like group) 大分支、19株田間分離株(field group)大分支，以及被夾在兩大分支中間的12株疑似重組毒株(suspected recombinant group)，本研究的GD02分離株和GX01分離株也歸屬這一類(帶三角形標記)，其中有3株毒株已確定為重組毒株(帶圓形標記)。但是在疫苗株大分支和田間株大分支的中間，這12株疑似重組毒株沒有共同形成1個大分支，存在4個小亞支，其中GD02株和GX01株與源于越南的4株LSDV分離株、GD01/2020株、中國臺灣毒株Taiwan/2020和中國香港HongKong/2020毒株同源性都很高，它們共同組成同一個小分支。

帶三角形紅色字體為本研究的2株毒株，帶圓形綠色字體的是此前研究中已確定的3株重組毒株

2.6 病毒重組分析對46個山羊痘病毒屬的全基因組序列使用RDP 軟件分析，得到大多數(shù)預測事件都將上述9株疑似重組毒株和3株已確定為重組毒株的基因組序列推測為重組體，共顯示了73個不同的假定重組事件，且所有這些事件均具有統(tǒng)計學意義，通過RDP軟件包中的RDP、GENECONV、Bootscan、Maxchi、Chimaera和3Seq至少一種方法計算，P值均小于0.05。圖6顯示了12個重組體的重組區(qū)域(淺色區(qū)域)，重組模式可以大致分為4種，重組模式Ⅰ由5株中國地區(qū)的LSDV毒株與4株越南LSDV毒株組成，重組模式Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為俄羅斯2017年LSDV分離株、哈薩克斯坦2018年LSDV分離株和俄羅斯2019年LSDV分離株。重組模式Ⅰ的主要親本為南非疫苗株(Neethling vaccine LW 1959)，次要親本主要為摩洛哥從牛獲得的田間株(LSD/KSGP 0240/Morocco/2017)，次要親本也有南非野毒(Neethling Warmbaths LW)、以哈薩克斯坦2016年LSDV野毒分離株改造的疫苗分離株(Neethling-RIBSP vaccine)，以及俄羅斯2015年LSDV野毒(LSDV/Russia/Dagestan/2015)。值得注意的是，它們都有1個假設(shè)重組事件是以GTPV-AV41為次要親本。

圖6 GD02和GX01等12個重組體的重組區(qū)域(淺色)

3 討論

本研究使用商品化檢測試劑盒鑒定了來自華南地區(qū)的2份疑似LSDV感染的皮膚結(jié)節(jié)組織為LSDV陽性，這2份樣品分別來源于廣東省潮州市和廣西壯族自治區(qū)百色市公布LSD疫情的牛群。痘病毒是一類最大的動物病毒，病毒粒子呈磚形或橢圓形，LSDV大小約為290 nm×270 nm[13]。本研究將處理后的病毒樣品通過透射電鏡觀察病毒粒子表面形態(tài)，捕捉到LSDV的2種病毒粒子——IMV和EEV，并觀察到有明顯的囊膜和外膜結(jié)構(gòu)特征。IMV外膜表面具有清晰的紋理結(jié)構(gòu)，是IMV外膜表面分布的若干不規(guī)則管狀結(jié)構(gòu)蛋白；EEV囊膜下的外膜橫截面有紋理結(jié)構(gòu)且有一定厚度[14]。本研究拍攝的LSDV電鏡圖豐富了LSDV病毒粒子微觀形態(tài)圖像，根據(jù)標尺估算圖中病毒粒子大小發(fā)現(xiàn)GD02株病毒粒子平均大小為300 nm×283 nm，GX01株病毒粒子平均大小為267 nm×233 nm，其中GD02株病毒粒子符合一般的LSDV粒子大小，GX01株病毒粒子略微偏小，可能是病毒處于不同的生長時期，而電鏡所拍到病毒粒子過少造成的統(tǒng)計偏差。值得注意的是，2株病毒粒子的大小都超過0.22 μm過濾器的濾過范圍，屬于大型病毒粒子，這提示在病毒分離培養(yǎng)時需要使用0.45 μm過濾器，而不是一般病毒分離所使用的0.22 μm過濾器。

本研究利用高通量測序獲取了2株華南地區(qū)LSDV全基因組序列，將其分別命名為China/GD02/2020(OM803091)和China/GX01/2020(OM803092)，這為國內(nèi)LSDV流行毒株的遺傳進化和病毒溯源研究奠定了基礎(chǔ)。LSDV基因組序列有高度保守性和遺傳穩(wěn)定性，GD02和GX01核苷酸同源性為99.99%，差異主要存在于基因組兩端。與參考毒株China/GD01/2020相比，核苷酸相似性均為99.9%，在編碼區(qū)存在4個氨基酸替換，造成2個截短ORF的產(chǎn)生。對GD02和GX01全基因組序列進行比對和遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)我國2020年暴發(fā)的多起LSD疫情(廣東、廣西、中國臺灣和中國香港)來源一致，與越南2020年LSDV分離株親緣性最高，同源性為100%，其次依次是俄羅斯2017年LSDV分離株(Saratov/2017)以及哈薩克斯坦2018年的LSDV分離株(KZ-Kostanay-2018)，與后兩者的遺傳距離相等。進一步使用RDP軟件分析全基因組序列，確定與GD02和GX01處于同一小分支的2020年中國香港、中國臺灣以及越南的LSDV分離株都是疫苗毒和田間毒的重組毒株，并且有共同來源的親本，其具體親本來源無法確定，可能是多個親本的重組，其中一個可能的親本是我國正在使用的GTPV-AV41減毒活疫苗。俄羅斯一直使用SPPV減毒活疫苗來防控LSD，但在分析2017年和2019年LSDV重組毒株的重組事件中未見LSDV與SPPV發(fā)生重組[12,15]。目前并沒有更多發(fā)生LSDV和GTPV重組的證據(jù)，這需要之后更多病毒基因組信息的監(jiān)測分析。此外，哈薩克斯坦2018年的LSDV分離株(KZ-Kostanay-2018)也是重組毒株，哈薩克斯坦使用肯尼亞獸醫(yī)疫苗生產(chǎn)研究所(KEVEVAPI)生產(chǎn)的lumivax?疫苗[16]，遺傳進化分析顯示該分離株與俄羅斯2017年和2019年的LSDV重組毒株處于不同分支。我國首起LSD疫情于2019年8月發(fā)生在新疆伊犁哈薩克自治州察布查爾錫伯自治縣，距哈薩克斯坦邊境約20 km，距俄羅斯邊境約780 km[8]，此起疫情發(fā)生在哈薩克斯坦2017年開始使用LSDV同源疫苗的接種活動之后[17]。根據(jù)張敏敏等[7]構(gòu)建的全基因組遺傳進化樹，確定LSDV/Xinjiang/2019分離株也是1株LSDV重組毒株，由于LSDV/China/Xinjiang/2020分離株的全基因組序列還沒有在GenBank公開，因此并不能準確判斷我國2020年LSD疫情是否與2019年新疆LSD疫情來源一致。

鑒于LSDV在我國的大范圍流行，以及其他國家使用減毒活疫苗免疫失敗的案例[18-19]，有必要重新評估減毒活疫苗的安全性和有效性，同時加快研發(fā)更加安全有效的新型疫苗。目前國外已有學者研發(fā)出一種安全有效的油性佐劑滅活LSDV疫苗，已在實驗室和野外條件下測試了該疫苗對牛的安全性、免疫原性和有效性，但仍需對免疫持續(xù)時間等方面進行進一步的探索和完善，尚未商品化生產(chǎn)[20]。為了控制LSDV在我國的進一步傳播，迫切需要在全國范圍內(nèi)調(diào)查LSDV的真實流行情況，并對更多的LSDV分離株進行全基因組測序，以便分析國內(nèi)LSDV流行毒株的遺傳演化過程，為進一步的LSD疫情溯源和防控策略制定提供依據(jù)。

本研究通過對疑似LSD的樣品進行qPCR檢測和透射電鏡鑒定，確定了來自我國華南地區(qū)的2份樣品均為LSDV陽性。通過LSDV全基因組測序、序列比對、遺傳進化分析和重組分析，獲得了2株華南地區(qū)LSDV的全基因組序列，并確定它們都是重組毒株，進一步確定2020年中國香港、中國臺灣和越南的LSDV分離株都屬于重組毒株，為國內(nèi)LSDV防控策略的制定提供了參考。