重組豬干擾素α的原核表達及抗病毒活性

李秀麗,韓 穎,趙 款,張武超,梁 飛,楊 歡,雷白時*,袁萬哲*

(1.河北農業大學，河北 保定 071001；2.河北省獸醫生物技術創新中心,河北 保定 071001；3.石家莊市動物基因工程藥物技術創新中心，河北 石家莊 050800；4.河北伯瑞動物藥業有限公司，河北 正定 050800；5.山東省莒南縣動物疫病預防控制中心，山東 莒南 276600)

20世紀30年代，人們發現機體感染一種病毒后,會出現阻止另一種毫無關系的病毒增殖的干擾現象(viral interference)[1]。1957年，有報道利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒的干擾現象時，發現被感染的細胞能產生一種因子，稱為干擾素(IFN)[2]。IFN在病毒感染和細胞免疫中起著至關重要的作用，是體內的第一道防線。IFN家族分為3種不同的類型：即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型IFN包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ、IFN-ζ[3]，IFN-α是其中之一。Ⅱ型僅有γ型1種,含有內含子。Ⅲ型IFN家族(IFN-λ) 由IL-29(IFN-λ1)、IL-28A(IFN-λ2)和IL-28B(IFN-λ3)組成[4]。

在人醫方面，IFN的研究較為全面，在動物方面，豬IFN(porcine interferon)是被最早研究的動物IFN之一，20世紀80年代就有關于豬IFN的報道。在各種類型的IFN當中，IFN-α的抗病毒作用最強，是異質性的，可以分為不同的亞型，目前已知有20余種亞型[5]。IFN通過結合細胞膜上的特異性受體，引發信號放大過程，將信號最后傳遞到細胞核內，對信號下游的基因表達進行調控，引發各種生理反應。在病毒侵襲的各個階段都有IFN刺激基因(ISGs)的參與，如Mx1、OAS、IFIT1、ISG15等，它們具有抗病毒及免疫調節等多種功能，能夠通過不同的途徑抵御病毒入侵和復制[6-7]。

我國是養豬大國，病毒性豬病種類繁多，危害巨大。這些豬病的流行特點是病毒變異速度快，發病特征非典型性，并且容易暴發。由于豬IFN-α是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等多種作用的糖蛋白，所以被廣泛應用于病毒性疾病的治療和預防，這已逐漸引起研究人員的關注[8]。腦心肌炎病毒(EMCV)是一種重要的人畜共患病病原體，感染后可引起動物和人類發生腦炎和心肌炎，以及神經系統疾病、糖尿病和繁殖障礙等多種疾病[9]。豬偽狂犬病病毒(PRV)感染主要是通過控制轉錄水平實現的，減壓閥的基因表達可以分為3個階段:立即早期基因(IE)、早期基因(E)和晚期基因(L)[10]。已有研究證實PoIFN-α可以有效治療口蹄疫[11]、豬流行性腹瀉[12]、豬繁殖與呼吸綜合征等[13]病毒性疾病，但rPoIFN-α是否可以有效抑制EMCV和PRV，相關研究報道較少。

近年來，基因重組技術迅速發展，己廣泛應用于各種生物制品的生產。基因工程重組人IFN-α是應用重組技術生產的最早的蛋白藥品之一[14]，也是當今能自主生產的少數基因工程藥物之一，利用基因重組技術獲得的人IFN，不僅實現了產業化，同時保留了蛋白的天然活性。鑒于此，本試驗將豬IFN-α基因克隆入原核表達載體上，轉入大腸桿菌中，由此獲得工程菌株，實現高表達。經一系列的體內體外研究發現，rPoIFN-α在體內外均具有良好的抗病毒活性，這為進一步重組蛋白生產的工業化提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；小鼠96T ELISA試劑盒購自北京冬歌生物技術有限公司；EMCV、PRV、豬睪丸細胞(ST)和豬腎細胞(PK-15)均由本實驗室保存；水泡性口炎病毒(VSV)由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈；BALB/c小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 rPoIFN-α的表達、純化和復性參照GenBank登錄的PoIFN-α序列(登錄號：KF414740.1)將信號肽序列去除，優化后合成重組質粒pET-32a-PoIFN-α。將重組質粒pET-32a-PoIFN-α 轉入感受態細胞 BL21(DE3)，使用引物PoIFN-F和PoIFN-R(表1)對單菌落進行鑒定。陽性菌進行擴大培養，按體積比1∶100接種LB中(含Amp)，37℃、200 r/min培養，待D600為0.4～0.6時，加入終濃度1.0 mmol/L 的IPTG，誘導4 h，離心收集菌體，超聲波破碎(360 W、30%、10 min)2次后，分離上清液和沉淀，進行SDS-PAGE檢測。參照Ni-Agatose Resin的純化步驟進行純化，采用透析復性法對蛋白進行復性。用0.22 μm 濾膜過濾除菌，分裝，-20℃ 保存。

1.3 重組蛋白Western blot檢測以Anti-His MousemAb為一抗，按照1∶5 000進行稀釋，充分混勻后覆蓋在PVDF膜上，室溫孵育1 h。以Goat Anti-MouseIgG作為二抗，按照1∶10 000進行稀釋，室溫孵育1 h，使用ECL顯色。

1.4 rPoIFN-α的細胞毒性檢測用MTT法測定rPoIFN-α作用PK-15和ST細胞后的活性。PK-15細胞在96孔細胞培養板生長至單層后，取制備好的重組蛋白用含2% FBS的DMEM營養液進行4倍倍比稀釋，共稀釋8個梯度，每個梯度8個重復孔。每孔100 μL，同時設置蛋白陽性對照孔及細胞陰性對照孔，孵育16～24 h后不棄培養基，加入10～20 μL MTT(質量濃度為5 g/L),包裹錫紙避光，37℃ 4 h。棄掉培養基，加入DMSO，100 μL/孔，避光搖勻，15 min內測定D450值。

1.5 rPoIFN-α在體外的抗病毒活性采用細胞病變抑制法測定rPoIFN-α蛋白在PK-15細胞上抗VSV增殖活性。PK-15在96孔細胞培養板生長至單層后，4倍倍比稀釋IFN，共稀釋9個梯度，每個梯度8個重復孔。每個梯度取100 μL加至96孔板中，于37℃、5% CO2細胞培養箱中孵育12～16 h，棄去培養液。將保存的VSV、PRV和EMCV溶液用含 2% FBS的DMEM營養液稀釋至100 TCID50，每孔加 100 μL。同時設計陽性對照(只用病毒處理)，陰性對照(共稀釋 64 倍的蛋白處理)和正常細胞對照(不做處理)。當觀察到的陽性對照組細胞出現75%以上病變時判定結果，按照Reed-Muench 法計算重組蛋白的抗病毒活性。

1.6 IFN刺激基因的表達水平使用能夠完全抑制VSV感染且劑量較低的rPoIFN-α蛋白對PK-15進行孵育，于不同時間(6，12，24，36，48 h)收集細胞，同時設置DMEM組，TRIzol法抽提細胞總RNA，將總RNA樣品反轉錄得到cDNA，引物序列見表1。RT-qPCR反應體系20 μL：2×AgueGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，45個循環；進行熔解曲線分析，95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s。

1.7 rPoIFN-α在小鼠體內的抗病毒活性6周齡BALB/c 小鼠25只隨機分為5組，分別為對照組、EMCV組、PRV組、 EMCV+rPoIFN-α組和PRV+rPoIFN-α組，EMCV病毒液3×105TCID50/0.1 mL，0.1 mL/只腹腔注射；PRV病毒液5×102TCID50/0.1 mL，0.1 mL/只背部皮下注射，攻毒1 d后腿部肌肉注射重組蛋白，50 μg/只。給藥后3，5，7，10，14 d每組尾尖采血，測定血清細胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β的變化；第14天全部處死，收取腦、心臟、肝臟和脾臟組織測定病毒載量，同時腦部組織測定IE180、EPO轉錄水平；在整個試驗期間記錄體質量變化以及根據臨床癥狀進行打分。

1.8 統計分析每個試驗重復3次。所有統計分析均采用SPSS 16.0軟件進行，通過RT-qPCR 檢測后，數據處理采用 2-△△Ct法計算。以*0.01

表1 引物信息

2 結果

2.1 rPoIFN-α的表達、純化和復性將合成的rPoIFN-α小提質粒轉入BL21中，經T7通用引物和序列特異性引物鑒定。將成功轉化后的陽性菌誘導表達，在1.0 mmol/L的IPTG誘導下進行可溶性分析，分別取誘導前全菌、誘導后的上清、沉淀和空載質粒進行SDS-PAGE分析，結果表明rPoIFN-α為包涵體表達；按照Ni-Agatose Resin的包涵體蛋白純化說明書進行蛋白的純化，透析復性后使用Nano Drop2000測定蛋白質量濃度平均為1.0 g/L，并進行SDS-PAGE鑒定，由圖1可知，純化復性后蛋白大小正確(35 kDa)，條帶單一。經Western blot驗證，成功獲得特異性目的蛋白。

A.重組蛋白的可溶性鑒定(M.蛋白Marker；1～6.pET-32a空載體未誘導、pET-32a空載體誘導、全菌未誘導、全菌誘導、沉淀、上清);B.重組蛋白純化與復性(M.蛋白Marker，1～2.分別為純化和復性后SDS-PAGE，大小為35 kDa);C.重組蛋白Western blot驗證(M.蛋白Marker；1.重組蛋白)

2.2 rPoIFN-α的細胞毒性如圖2所示，MTT法測定rPoIFN-α對細胞活力的影響，在PK-15和ST細胞上，隨著蛋白稀釋倍數的增加，其對細胞活性的影響越接近對照組，當稀釋度為4-4時，80%以上的細胞未受損傷，這為后續試驗提供可能。

A.蛋白作用后PK-15細胞活力;B.蛋白作用后ST細胞活力。**示P<0.01。下同

2.3 rPoIFN-α在體外抗病毒活性通過PK-15/VSV系統檢測rPoIFN-α蛋白的抗病毒活性，參照Reed-Muench法，計算距離比例為(高于50%細胞無病變百分比-50%)/(高于50%細胞無病變百分比-低于50%細胞無病變百分比),可得重組蛋白的活性效價為1.25×105U/mL。同理測得rPoIFN-α在PK-15和ST細胞上抗EMCV和PRV的活性(表2)。

表2 rPoIFN-α在不同細胞上抗病毒活性 U/mL

2.4 ISGs轉錄水平的測定收取rPoIFN-α作用后的PK-15細胞，測定Mx1、OAS、IFIT1、ISG15、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的轉錄水平。結果顯示，重組IFN孵育細胞后，與DMEM對照組相比顯著上調了各細胞因子，且在6 h時，表達水平達到峰值(圖3)。

A～F.ISG15、Mx1、OAS、IFIT1、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ在0，6，12，24，36，48 h時的表達水平

2.5 rPoIFN-α在小鼠體內抗病毒作用

2.5.1生存曲線 根據試驗期間小鼠的死亡情況繪制了生存曲線，如圖4所示，EMCV、PRV組在4 d 出現死亡，EMCV、PRV組分別在9，10 d全部死亡，病死率為100%，EMCV治療組病死率為20%，PRV治療組病死率為0%。

圖4 病毒感染組以及IFN治療組小鼠的死亡情況

2.5.2各組織器官病毒載量 第14天處死全部小鼠，取腦、心臟、脾臟、肝臟組織，測定各組織的病毒載量，如圖5所示，EMCV治療組腦中病毒載量低于EMCV陽性對照組，呈極顯著差異；脾臟中EMCV載量也顯著低于對照組。

A.EMCV感染組和rIFN-α治療組心臟、肝臟、脾臟和腦的病毒載量;B.PRV感染組和IFN-α治療組心臟、肝臟、脾臟和腦的病毒載量

2.5.3血清細胞因子水平的變化 EMCV和PRV感染后，IL-6、IL-1β、TNF-α的水平升高，重組IFN治療后5～7 d，三者水平較未感染組略有升高，但仍低于感染組，而治療組IL-10的水平在3，5，7 d均高于病毒感染組(圖6)。

A～D.依次為3，5，7 d時，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量

2.5.4臨床癥狀 病毒感染后，觀察記錄小鼠表現，當出現體質量減輕、被毛粗亂、互相啃咬、采食量降低和神經癥狀時分別記1分，沒有癥狀記為0分，根據所得分值繪制曲線。結果顯示，在第3天時病毒感染組開始出現癥狀，而重組IFN治療后在第5天才開始出現輕微的癥狀(圖7)。

2.5.5IE180、EPO的轉錄水平 取小鼠腦組織，測定其相對表達量。結果顯示，病毒感染后IE180和EPO的表達水平均顯著高于未感染組和治療組，這說明用重組IFN治療后，通過減少2種蛋白的轉錄，抑制了PRV的增殖，起到抗病毒效果(圖8)。

圖7 小鼠臨床癥狀得分情況

圖8 PRV感染組和IFN-α治療組小鼠腦組織中IE180、EPO的表達水平

3 討論

當今豬病形勢復雜，病毒性疾病占主導地位，特別是近幾年暴發的豬流行性腹瀉、豬偽狂犬病給養殖業造成了巨大的經濟損失[15]。IFN生物制劑由于其自身優勢成為了新的研究熱點。1986年，LEFEVRE等[16]首次利用大腸桿菌表達PoIFN-α，因其具有速效多能、無殘留、無副作用等特點，且不會對人類健康造成危害，已成為替代化學合成抗病毒藥物的理想新藥。因此我國學者也相繼開展了PoIFN-α的研究，實現了PoIFN-α的體外表達，在生產實踐中操作簡單、產量大，有良好的應用前景[17]。

本試驗成功獲得穩定表達的rPoIFN-α，并使用多種體外系統進行了活性測定。其中，VSV/PK-15系統是豬IFN抗病毒活性檢測系統中使用最廣泛的活性測定方法[18]。本研究表達的rPoIFN-α抗病毒比活性達到1.67×106IU，MTT法測定rPoIFN-α細胞的增殖活性，結果發現，當重組蛋白稀釋到4-4時，80%以上的細胞未損傷，這說明rPoIFN-α對豬源PK-15和ST細胞的損傷均在可控范圍內，與吳夢礬[19]的研究相比有了較大提升。Ⅰ型 IFN 通過 JAK-STAT 信號通路發出信號，以刺激 ISGs 等抗病毒效應物的產生。通過檢測IFN信號通路下游ISGs 的轉錄水平，能夠更直觀地證實重組融合蛋白的抗病毒潛力。試驗獲得的rPoIFN-α在作用PK-15細胞后6 h顯著上調Mx1、OAS、IFIT1、ISG15基因的表達水平，結果與報道相一致[20]，在檢測的細胞因子中，MHC-I和 MHC-Ⅱ的表達不顯著，這與其抗病毒機制有關。

在小鼠體內，EMCV和PRV感染組各組織器官的病毒載量均高于IFN-α治療組，病毒滴度在腦內最高，其原因可能與PRV和EMCV屬嗜神經病毒有關。結果表明，rPoIFN-α可以有效抑制病毒粒子在腦、心臟、肝臟和脾臟中的增殖，與病毒感染組相比具有顯著性差異。細胞因子參與免疫和炎癥反應，在保護身體免受外來病原體侵害方面發揮關鍵作用，TNF-α、IL-Iβ和IL-6屬于促炎因子，參與促進急性炎癥反應以防御感染。本研究中，病毒感染后促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高；這提示PRV和EMCV激活了先天免疫[21]。而rPoIFN-α治療組，這些促炎細胞因子水平在5 d時低于感染對照組，提示rPoIFN-α可在感染早期減弱炎癥反應，抑制病毒復制，在7 d時逐漸恢復正常，避免嚴重炎癥的發生；與此同時，rPoIFN-α治療組的小鼠體內IL-10水平在5，7 d顯著上升，高于病毒感染組，IL-10作為抗炎因子之一，結果表明rPoIFN-α起到了積極的抗病毒作用。根據EMCV和PRV感染小鼠后出現的癥狀，設置打分標準，對試驗期間的小鼠進行觀察記錄，同時記錄小鼠的死亡情況，結果顯示，EMCV和PRV感染組在4 d出現死亡，于9，10 d全部死亡，而PRV治療組全程未出現死亡，EMCV治療組在6 d死亡2只，其余均存活；根據打分結果，治療組小鼠出現臨床癥狀較感染組晚，且癥狀較輕。

病毒復制的關鍵步驟包括病毒基因轉錄，因此，通過阻斷基因轉錄抑制病毒增殖是一種有效的方法。IE180是PRV唯一的直接早期基因，是一種可啟動早期基因轉錄的轉錄激活因子。EPO是PRV復制周期的早期蛋白之一，其水平的高低意味著PRV增殖的快慢。在本研究中，重組豬IFN治療組IE180和EPO的表達水平均低于PRV感染組，即PRV在小鼠體內增殖速度減慢，這也說明了重組豬IFN可在小鼠體內起到抗PRV的作用。

本試驗結果表明，原核表達rPoIFN-α具有理想的體內外抑制PRV和EMCV的活性，為今后rPoIFN-α抑制PRV和EMCV的臨床試驗奠定了基礎。