豬薩佩羅病毒對仔豬的致病性

劉佳佳，李本強，陶 潔，石 迎，程靖華，喬長濤，劉惠莉*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106；2.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院,上海 201306；3.上海市種豬工程技術(shù)中心，上海 201106)

豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus,PSV)屬于小RNA病毒科，薩佩羅病毒屬，直徑25～30 nm，病毒粒子呈微球狀，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。PSV全基因組7.5～8.3 kb，含有1個大的開放閱讀框(ORF)，編碼1個長度約2 330個氨基酸的多聚蛋白前體，多聚蛋白前體隨后被自身編碼的蛋白酶裂解為4個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[2]。

1958年，英國首次報道PSV，目前該病毒已在全世界范圍內(nèi)流行[3]。2011年，LAN等[4]首次報道在我國豬場分離出PSV。近年來有較多PSV的研究報道[4-6]。仔豬感染PSV后臨床主要引起腹瀉、肺炎、腦脊髓灰質(zhì)炎等癥狀[7-9]。PRODLALOV[7]報道，PSV存在無癥狀感染現(xiàn)象，且PSV無癥狀感染存在較高比例，這可能也是人們對PSV關(guān)注不高的原因。但近年發(fā)現(xiàn)PSV感染比例升高，且與豬流行性腹瀉病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬星狀病毒、豬腸道病毒等混合感染較為普遍，從而引起研究人員對PSV的關(guān)注[10-12]。2017-2019年華東地區(qū)臨床豬腹瀉樣品檢測發(fā)現(xiàn)PSV病原感染陽性率為3.87%[13]。董馨等[14]對寧夏不同區(qū)域豬場檢測發(fā)現(xiàn)PSV豬場感染率為100%，且PSV總體平均陽性率達61.25%。在江西調(diào)查發(fā)現(xiàn)2018-2019年仔豬腹瀉樣品中PSV陽性率達11.22% (33/294)[15]；此外，我國華南、華東、四川、湖南地區(qū)均有PSV感染的報道及相關(guān)研究，豬場陽性率高達46.39%[16-18]，提示我國豬場PSV感染普遍存在。本團隊自2015年開始，對上海及周邊地區(qū)豬場腹瀉病原進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)PSV陽性率上升趨勢明顯，2015年為15.87%，2019年為21.58%，2021年為34.11%，并分離到多種PSV病原[6]。

本研究建立了分離株SHCM2019感染仔豬模型，并對病毒感染后組織定位和致病變作用進行研究，為深入了解PSV在仔豬腹瀉疾病中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株與實驗動物PSV毒株SHCM2019(GenBank登錄號：MN685785)由上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定、保存。病毒由PK-15細胞擴增。5日齡仔豬購自江蘇某豬場，健康狀況良好，PSV抗體陰性。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol試劑、PrimeScriptTMRT試劑盒、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；臺式離心機購自上海寶賽生物科技有限公司。

1.3 試驗分組與PSV感染將10頭仔豬隨機分為2組，試驗組與對照組。試驗組仔豬每頭頸部肌肉注射5 mL(107TCID50/mL)病毒液，對照組注射等劑量DMEM，并進行隔離飼養(yǎng)。所有仔豬均保證充足飲水，喂料。

1.4 樣品采集與檢測每天統(tǒng)計仔豬腹瀉、飲水、采食、體溫、死亡等臨床表征；采集仔豬糞便(肛拭子)，檢測排毒情況；腹瀉后，繼續(xù)觀察2 d，癥狀不明顯時剖檢，采集仔豬各臟器(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié))及腸組織(十二指腸、空腸、回腸)，一部分組織樣品用40%甲醛固定用于制作切片，HE染色；另一部分組織樣品，液氮研磨后，利用熒光定量RT-PCR檢測病毒含量。試驗組與對照組仔豬分別在感染0，3，7，10，14 d采集抗凝血1 mL，分離外周血單核細胞。

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄TRIzol法提取細胞總RNA，以總RNA為模板，參照PrimeScriptTMRT說明書進行基因組反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為熒光定量RT-PCR模板。

1.6 引物和相對定量PCR實時熒光定量PCR引物信息參照文獻[3,10]。熒光定量PCR反應(yīng)體系：樣品cDNA 1 μg、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL、滅菌水7 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，共20 μL。每個樣品3個重復孔，瞬間離心后，放入實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95℃，然后降至60℃，開始以0.5℃/s遞增至95℃檢測熒光信號得出擴增產(chǎn)物的溶解曲線。以豬β-actin基因作為內(nèi)參，將感染病毒前細胞因子表達量設(shè)為1倍。

1.7 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；各時間點之間采用F檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，每個試驗重復3次，制圖由Graphpad 5.0完成。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察每天測量豬只體溫，試驗組仔豬體溫明顯低于對照組(圖1)。試驗組4頭仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀，48 h死亡1頭。剖檢可看出腸管鼓氣，腸壁變薄呈透明狀，腸道內(nèi)容物稀軟；肺部腫脹，左肺尖葉有大面積出血；淋巴質(zhì)地變軟，嚴重充血(圖2)。對照組仔豬臨床表現(xiàn)正常，剖檢腸道正常，內(nèi)容物無異常。

圖1 體溫監(jiān)測

A.對照組肛門干凈，無附著物；B.試驗組肛門周圍有糞便附著；C.對照組腸管厚實有彈性，內(nèi)容物無異常；D.試驗組腸管鼓氣呈透明狀；E.對照組肺正常；F.試驗組肺部腫脹，左肺尖葉大面積出血；G.對照組淋巴正常；H.試驗組淋巴腫脹充血

2.2 組織病毒載量測定采集臨床腹瀉癥狀明顯的仔豬組織臟器，包括淋巴結(jié)、肺臟、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸等，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒載量。試驗組仔豬腸道及肺部病毒含量較高，且盲腸、結(jié)腸、直腸中的病毒含量略高，淋巴結(jié)病毒含量較低，心臟、肝臟、腎臟未檢測到病毒核酸 (圖3)。

圖3 組織病毒載量檢測

2.3 組織病理學變化采集攻毒仔豬腸道及肺臟組織進行切片及HE染色。結(jié)果顯示，試驗組肺泡間隔增寬，肺泡壁增厚，肺泡壁毛細血管及肺間質(zhì)血管高度擴張充血(圖4B)；盲腸局部黏膜上皮細胞壞死、脫落、部分變性，淋巴增生、炎性細胞浸潤(圖4D)；直腸試驗組黏膜上皮細胞脫落，有細胞變性、壞死、空泡化等特征，淋巴細胞增生、顆粒變性分不清(圖4F)。

A.對照組肺泡間隔均勻；B.試驗組肺泡間隔增寬，肺泡壁增厚；C.對照組盲腸正常；D.試驗組盲腸炎癥細胞浸潤，大量紅細胞聚集；E.對照組直腸正常；F.試驗組直腸腸絨毛上皮細胞斷裂脫落，固有層單核炎癥細胞浸潤

2.4 細胞因子檢測采集仔豬外周血，檢測細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)試驗組仔豬炎性因子與對照組比較均有升高。IL-1α在3 d時因子水平上升顯著(P<0.05)；IL-6在3 d升高顯著，14 d表達水平均存在顯著性差異(P<0.05)。IL-2表達水平在10 d后顯著升高(P<0.05)。MX1在攻毒后表達持續(xù)上升，與對照組差異顯著 (P<0.05) (圖5)。結(jié)果顯示，PSV感染仔豬，先誘導Th2型抗炎反應(yīng)，刺激體液免疫應(yīng)答；后期誘發(fā)Th1型細胞促炎性免疫反應(yīng)，通過細胞免疫系統(tǒng)活化釋放細胞因子對抗病毒；與MX1抗病毒因子表達規(guī)律一致，顯示攻毒前期水平較低，后期持續(xù)升高，14 d達到最高水平，發(fā)揮炎性因子抗病毒效應(yīng)。

A.IL-1α;B.IL-2;C.IL-6;D.MX1。與0 dpi細胞因子水平比較，*表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

對PSV致病性研究結(jié)果顯示，PSV感染仔豬引起以腹瀉為主的臨床癥狀，還包括食欲減退、共濟失調(diào)、精神遲鈍、對外界環(huán)境刺激反應(yīng)降低[19-20]。LAN等[4]用PSV感染斷奶仔豬第2天出現(xiàn)腹瀉及呼吸窘迫綜合征，7 d出現(xiàn)腦脊髓灰質(zhì)炎，表現(xiàn)為共濟失調(diào)和雙腿麻痹。本研究感染仔豬表現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀，沒有出現(xiàn)腦脊髓灰質(zhì)炎，腦組織中也并未檢測到PSV核酸，顯示不同PSV毒株致病作用存在一定差異，或者與感染劑量有關(guān)，分離毒株SHCM2019感染仔豬導致體溫下降，顯示可能抑制了機體免疫應(yīng)答。

腸黏膜是腸道病原感染和入侵的最外側(cè)屏障，腸道病毒通過黏膜上皮細胞受體進入腸道上皮細胞，進而定植到相應(yīng)的靶組織。研究發(fā)現(xiàn)PSV在感染仔豬腸道內(nèi)各段均有分布，且病毒載量較高，表明PSV對腸道親嗜性高。剖檢也發(fā)現(xiàn)腸道病變最為明顯，包括腸管腫脹且腸壁變薄，是典型的腸炎癥狀，與臨床腹瀉癥狀吻合。與前面報道一致的是，PSV可引起類似的腸道病變與肺部病變，如小腸和大腸黏膜增厚，回腸黏膜褶皺明顯，形成縱向結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)或波紋；肺下葉部分實變，左肺上葉出現(xiàn)出血點[11,21]。

機體對PSV感染進行免疫應(yīng)答的過程中，PBMC細胞群體及其分泌的白介素類細胞因子起著重要作用，是機體抵抗病毒感染的第一道防線。本研究中，IL-1α、IL-6在攻毒初期，表達水平顯著升高，顯示誘導Th2型免疫應(yīng)答；10 d后IL-2水平顯著提升，TH1型免疫反應(yīng)激活。

由此可知，PSV攻毒仔豬，能誘導TH1、TH2型免疫應(yīng)答，且先活化Th2型免疫反應(yīng)刺激體液免疫應(yīng)答，隨后活化TH1型細胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮病毒殺滅作用。MX1是由Ⅰ型干擾素誘導宿主細胞產(chǎn)生的抗病毒蛋白，可在沒有干擾素誘導蛋白時單獨阻止病毒復制[22-23]。本研究PSV 感染仔豬后，MX1表達量逐漸升高，以應(yīng)對病毒感染，發(fā)揮其抗病毒效應(yīng)。

本研究證實仔豬感染SHCM2019分離株后，仔豬出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，并出現(xiàn)死亡，病毒感染的主要靶器官為腸道、肺臟及淋巴結(jié)。剖檢可見明顯的腸道病變、肺部病變以及淋巴結(jié)質(zhì)地充血變軟。PSV感染仔豬后同時激活體內(nèi)TH1和TH2型細胞免疫反應(yīng)。