基于變異PEDV的S-N融合雙基因蛋白IgA-ELISA抗體檢測方法的建立及應用

王隆柏，陳秋勇，曾憲煜，吳學敏，車勇良，陳如敬，周倫江*

(1.福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福建 福州 350013；2.長汀縣畜牧技術推廣站，福建 長汀 366300)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起豬的急性腸道傳染病，以食欲下降、腹瀉、嘔吐和脫水為特征。2010年下半年以來，由于PEDV變異導致該病再次席卷全球，給養豬業造成了重大的經濟損失[1-2]。PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，編碼纖突蛋白(S蛋白)、小包膜蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)等4種主要結構蛋白[3]。PEDV S蛋白由S基因編碼，1 383個氨基酸構成。S 蛋白可分為S1(第1～789位氨基酸)和 S2(第790～1 383 位氨基酸)2 個功能區[4]，其中 S1 區包含了病毒主要的中和表位和受體結合域，有3 個誘導中和抗體產生的表位和1個誘導中和抗體產生的區域 (第499～638位氨基酸)。S 蛋白具有識別靶細胞并且使病毒和細胞膜融合的作用[5]，且在介導病毒感染、侵入細胞以及毒株變異、抗原和毒力改變等方面均起關鍵作用[6-7]。N蛋白由 441個氨基酸組成，具有高度保守性，含 6～7個潛在的磷酸化位點。N蛋白是病毒的主要免疫蛋白之一，能夠誘導機體產生特異性的抗體免疫和細胞免疫，豬在早期感染PEDV,就可以產生抗N蛋白的高水平抗體[8-9]，使其成為早期診斷的靶蛋白。

由于PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)及博卡病毒在流行病學、臨床癥狀和病理表現極其相似，因此本病僅依據流行病學、臨床癥狀和病理變化很難做出診斷,特別是與TGEV和德塔病毒不易區別,必須依靠實驗室技術才能作出診斷。目前,已建立的PEDV診斷方法有病毒分離、免疫電鏡、免疫熒光、間接血凝試驗、夾心酶聯免疫吸附試驗、RT-PCR、熒光定量RT-PCR方法等[10]，適用于對病毒的病原檢測。在抗體檢測方面雖然建立了中和試驗、IgG-ELISA和IgA-ELISA抗體方法，但病毒中和試驗操作繁雜并且耗時長，采用全病毒包被建立的ELISA方法存在病毒培養困難且多容易造成病毒擴散。IgG-ELISA抗體檢測方法主要用于檢測血清中的抗體，IgA-ELISA抗體檢測方法主要用于檢測乳汁中的抗體，且應用截斷的S蛋白或單個N蛋白建立的ELISA方法僅能檢測到單個蛋白產生的抗體，而采用變異PEDV毒株S-N融合蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，在血清和乳汁中檢測S蛋白和N蛋白產生的PEDV的IgA抗體未見報道。

鑒于此，本研究通過截取變異PEDV S蛋白具有誘導中和抗體產生的區域(第499～638位氨基酸)與N蛋白融合，通過真核表達載體，獲得具有免疫原性的S-N融合雙基因蛋白。以S-N真核蛋白為包被抗原，通過ELISA反應條件優化，建立在血清和乳汁中檢測PEDV的S蛋白和N蛋白IgA抗體ELISA 方法，為該病的血清抗體調查和免疫疫苗效果評估奠定基礎，為防控PEDV提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料磷酸鹽包被緩沖液、BSA、山羊抗豬IgA-HRP(辣根過氧化物酶)、TMB顯色液、終止液、洗滌液均購自Abcam生物公司；TGEV、PoRV陽性血清均購自哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司；偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清均購自IDEXX公司；進口商品化ELISA抗體檢測試劑盒購自BIONOTE 公司；PEDV的S-N雙基因融合蛋白、PEDV陽性血清、陰性血清均由本實驗室制備與保存。

1.2 S-N融合蛋白的制備參照文獻[2]方法進行。采用同源重組的原理，通過擴增變異PEDV的S、N基因，連接到真核表達載體，構建S-N雙基因融合質粒，再將融合質粒轉染到293T細胞中，表達出相應的S-N雙基因融合蛋白。采用按EQKLISEEDL純化試劑盒說明進行純化獲得蛋白，作為ELISA方法的包被抗原。

1.3 優化包被蛋白質量濃度將蛋白分別以1，2，4 mg/L 稀釋，每個稀釋度做8孔重復，100 μL/孔，4℃過夜；5% BSA封閉液封閉抗原蛋白，300 μL/孔，37℃孵育2 h;洗板,加入陽性血清與陰性血清分別1∶10稀釋，100 μL/孔，37℃孵育1 h;洗板,再加入1∶10 000稀釋羊抗豬HRP，100 μL /孔，37℃孵育30 min;洗板,加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光37℃孵育10 min;加入終止液，50 μL/孔，搖勻；用酶標儀讀取D450 nm值,P代表陽性血清的D450 nm值，N代表陰性血清的D450 nm值，選擇P/N值最大者為最佳包被抗原質量濃度。

1.4 優化包被蛋白時間選用2種包被時間進行優化，分別為4℃過夜和37℃孵育2 h。陰性血清和陽性血清分別以1∶10稀釋，進行ELISA測定，最后比較450 nm波長下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為包被條件最適時間。

1.5 優化最佳封閉液以最適抗原蛋白的包被質量濃度和最佳包被時間包被酶標板，洗板，分別用PBST、1% BSA、2% BSA、5% BSA進行封閉，300 μL/孔，37℃孵育2 h，陰性血清和陽性血清分別以1∶10稀釋，進行ELISA測定，最后比較450 nm 波長下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳封閉液。

1.6 優化酶標抗體稀釋度以最適抗原蛋白包被和最適封閉條件封閉，陽性血清和陰性血清1∶10稀釋，37℃孵育1 h；洗板，加入抗豬IgA-HRP 1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000稀釋，100 μL/孔，37℃孵育30 min；洗板，進行ELISA測定。最后比較450 nm波長下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳稀釋度。

1.7 優化血清稀釋度陽性血清和陰性血清1∶10，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400稀釋，37℃孵育1 h，洗板，進行ELISA測定。最后比較450 nm波長下陰性、陽性血清的P/N值，最大者為最佳稀釋度。

1.9 特異性試驗利用已建立的ELISA方法檢測PoRV、TGEV、CSFV、PRRSV、PRV陽性血清，血清按照1∶50稀釋，并設立陽性和陰性對照，檢測方法的特異性。

1.10 敏感性試驗選取陽性血清，在稀釋1∶200的基礎上分別進行倍比稀釋，并設立陽性和陰性對照，檢測建立方法的敏感性。

1.11 重復性試驗

1.11.1批內重復性 在同一批制備的ELISA板中，隨機挑選8份血清，按照1∶50稀釋，每個血清各做3個孔，計算s和變異系數(CV)，分析批內重復性。

1.11.2批間重復性 在隨機選擇3批制備的ELISA板中隨機挑選8個血清，按照1∶50稀釋，每個血清各做3個孔，計算s和CV，分析批間重復性。

1.12 臨床檢測利用已建立的ELISA檢測方法對從不同規模豬場采集的179份血清樣品和125份乳汁樣品進行臨床檢測，并用對照商品化試劑盒進行檢測，最后進行統計和分析，比較兩者之間的符合率。

2 結果

2.1 包被抗原蛋白最適質量濃度的確定結果顯示，當抗原蛋白質量濃度為2 mg/L時，P/N值為最佳(表1)。

表1 包被抗原蛋白質量濃度優化

2.2 包被最佳時間的確定結果如表2所示,抗原蛋白在4℃包被過夜，P/N值為最佳。

表2 抗原蛋白包被時間優化

2.3 最佳封閉液的確定結果顯示,使用5% BSA (BOSTER)作為封閉液，P/N值為最佳(表3)。

表3 封閉液優化

2.4 酶標抗體稀釋度的優化由表4可見，Anti-pig IgA酶標二抗稀釋度為1∶20 000，P/N值最大。

表4 Anti-pig IgA酶標抗體濃度優化

2.5 血清稀釋度的優化結果顯示，當血清稀釋度為1∶50時，P/N值最大，效果最佳(表5)。

表5 血清稀釋度優化

表6 陽性與陰性臨界值的確定

2.7 敏感性試驗結果如表7所示，該檢測方法能檢測到1∶3 200倍稀釋的血清抗體，具有較好的敏感性。

表7 敏感性測定

2.8 特異性試驗結果如表8所示，該檢測方法檢PRRSV、PRV、CSFV、TGEV、PoRV陽性血清均是陰性，無交叉反應，僅檢測PEDV陽性血清為陽性。

表8 特異性測定

2.9 重復性試驗結果如表9所示，檢測方法在批內重復性和批間重復性的CV均小于10%，說明建立的檢測方法具有很好的重復性。

表9 重復性測定

2.10 臨床檢測共檢測血清179份，利用進口商品化檢測試劑盒，檢測得到陽性樣品135份，陰性樣品44份；利用本研究建立的方法檢測出陽性樣品137份，陰性樣品42份，與進口試劑盒的陽性符合率達到了97.8%，陰性符合率達到90.9%，總符合率為93.2%，見表10。共檢測乳汁125份，利用進口商品化檢測試劑盒檢測得到陽性樣品101份，陰性樣品24份；利用本研究建立的方法檢測出陽性樣品104份，陰性樣品21份，與進口試劑盒的陽性符合率達到100.0%，陰性符合率達到 87.5%，總符合率為 93.75%(表11)。表明建立的ELISA檢測方法適用于PEDV的臨床樣品檢測，對監測PEDV疫苗免疫抗體或豬群的感染情況具有重要意義。

表10 建立的方法與ELISA試劑盒檢測血清比較

表11 建立的方法與ELISA試劑盒檢測乳汁比較

3 討論

PED是導致豬群腹瀉尤其是哺乳仔豬發病死亡的重要疫病，2010—2011年嚴重影響了我國的生豬養殖業，現在仍時有發生。該病一年四季都可發生，但以寒冷的冬、春季節發病更為嚴重。當前，PED的防控主要在做好豬場生物安全的情況下，采用弱毒疫苗或滅活疫苗在母豬群產前免疫，由于出生仔豬免疫功能不完善，產生自身免疫抗體十分弱，仔豬只能通過從母豬的乳汁中獲得母源抗體，從而達到保護仔豬的效果。大量研究表明，仔豬通過母豬乳汁獲得母源的抗體主要為腸道黏膜分泌的IgA 抗體，IgA 抗體能抵御入侵的病原體，仔豬從而獲得被動免疫保護。IgA 作為黏膜免疫系統的重要效應因子，其主要特性是多鏈性、黏膜親和性以及對蛋白酶的抵抗性，這有助于抗體對病毒的親和作用，并具有阻抑黏附、免疫排除和中和病毒等多種生物功能[11-12]。可見，PED疫苗免疫后母豬乳汁中的 IgA 抗體水平是評價疫苗免疫原性的一項重要指標，檢測血清中的IgG 抗體來評價疫苗保護的方法存在缺陷。鑒于血清特異PEDV IgA抗體水平與局部黏膜免疫水平呈正相關[13-14]，通過該方法檢測血清中的IgA抗體，能間接反映出乳汁中IgA抗體的情況。因此建立一種安全、穩定的IgA 抗體 ELISA 檢測方法對PED的防治具有重要臨床實踐意義。

在PEDV ELISA抗體檢測方面，王麗珍等[15]通過純化的PEDV為包被抗原，建立了檢測PED IgG抗體間接ELISA檢測方法，與哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司提供的商品檢測試劑盒的符合率為81%。丁振江等[16]通過S 蛋白 S1 亞基的S1D區 (636～798 aa)，原核表達出S1D區蛋白，并以該蛋白建立了檢測PED IgA 抗體間接 ELISA 檢測。該方法能檢測到240 倍稀釋的陽性乳汁，和韓國BIONOTE 公司生產的 IgA 抗體檢測試劑盒進行對比，符合率為93.82%，但該方法只能檢測到乳汁中IgA抗體。陳靜等[17]通過S蛋白的N端高變區(22～380 aa)，原核表達出了S蛋白，并以該蛋白建立了檢測PED IgG抗體間接 ELISA 檢測方法。鄭逢梅等[18]將PEDV N基因上2個大的抗原表位區(112～321 aa)克隆至原核表達載體pET-32α，表達出N蛋白，并建立了基于N基因主要抗原表位檢測IgG的ELISA方法，該方法與深圳芬德生物技術有限公司的PDE抗體診斷試劑盒的符合率100%。這些檢測方法中有采用PEDV全病毒、截斷的S蛋白或N蛋白作為包被抗體建立了IgG-ELISA抗體檢測方法，也有采用截斷的S蛋白作為包被抗原建立IgA-ELISA抗體檢測方法，但這些方法存在病毒擴散帶來的風險或只能檢測血清中的IgG抗體或乳汁中的IgA抗體，且都存在不能同時檢測到血清中和乳汁中S、N蛋白IgA抗體的局限性。

本研究通過采用真核表達載體表達出的S-N雙基因融合蛋白，作為包被抗原，建立了PEDV IgA-ELISA抗體檢測方法。該方法檢測PRRSV、PRV、CSFV、TGEV、PoRV陽性血清結果均是陰性，即為無交叉反應，能檢測到1∶3 200倍稀釋的血清抗體，批內重復性和批間重復性的CV均小于10%，與BIONOTE 公司生產的 IgA 抗體商品化檢測試劑盒總符合率達到93.2%以上，可同時檢測到血清和乳汁中PEDV的IgA抗體。因此，本研究建立的PEDV IgA-ELISA抗體檢測方法，適合對PED的抗體監測和疫苗免疫進行效果評價，為進一步確保豬群健康提供了有力的技術支撐。