SADS-CoV S1蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

張睿玉，李龍駒，李 程，周 玲，馬靜云

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 畜禽健康養(yǎng)殖與疾病防控研究室，廣東 廣州 510642)

2017年1-4月份在我國(guó)南部幾個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的新生仔豬群中相繼暴發(fā)豬急性腹瀉綜合征(SADS)，感染仔豬臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重水樣腹瀉，伴隨劇烈嘔吐，極度脫水，5日齡以下仔豬死淘率高達(dá)100%，造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。通過(guò)病毒的分離鑒定，高通量測(cè)序技術(shù)獲得病毒基因組序列，初步確認(rèn)該病毒是一種新發(fā)冠狀病毒，并與蝙蝠冠狀病毒HKU2基因組序列高度相似，將其命名為豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)。回顧性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，至少自2016年8月開始，SADS-CoV已在廣東省多個(gè)豬場(chǎng)流行[3]。截止目前，其他國(guó)家和地區(qū)尚無(wú)SADS-CoV的相關(guān)報(bào)道。

SADS-CoV屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，是截至目前為止發(fā)現(xiàn)的第6種豬源冠狀病毒。SADS-CoV的基因組全長(zhǎng)約為27 kb，兩端為5′- UTR與3′- UTR，其間約有1/3的區(qū)域編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為刺突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)、膜糖蛋白(M)和包膜蛋白(E)，這4種結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于維持病毒顆粒的完整性有著重要的生理意義。其中，SADS-CoV S蛋白作為最大的結(jié)構(gòu)蛋白位于病毒粒子的表面，是由1 130個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，大小為180～250 kDa。S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成，S1亞基作為吸附細(xì)胞的前提條件，不僅擁有病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體結(jié)構(gòu)域，在病毒感染宿主的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并且能夠介導(dǎo)宿主機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，是研發(fā)抗SADS-CoV感染高效疫苗的理想靶標(biāo)。此外，S1亞基的三聚體結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)可以幫助病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[4-5]。S2亞基主要介導(dǎo)病毒-細(xì)胞以及細(xì)胞-細(xì)胞膜融合，僅可誘發(fā)較弱的中和抗體。

本研究根據(jù)SADS-CoV/GDGL/2017毒株序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增S1基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體后表達(dá)并純化S1蛋白，利用該重組蛋白免疫小鼠，最終制備出針對(duì)S1蛋白的多克隆抗體，為實(shí)現(xiàn)SADS-CoV血清學(xué)診斷、致病機(jī)制深入研究等奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒(菌)株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SADS-CoV毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pGEX-6P-1源于Addgene；Vero E6細(xì)胞購(gòu)自通派(上海)生物科技有限公司；6～8周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑病毒RNA提取試劑(Axygen)，PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨芐青霉素、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)購(gòu)自Sigma公司；蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Glutathione Sepharose 4B(GE)、山羊抗鼠HRP-IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒、ECL曝光液購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；膠回收試劑盒(Omega)購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成參考SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株序列S蛋白基因序列(GenBank:MG605090.1)，選擇S蛋白S1結(jié)構(gòu)域N-CTD(18-402AA)設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)遵循無(wú)縫克隆原則，引物序列信息見表1。

1.4 擴(kuò)增SADS-CoV S1基因和線性pGEX-6P-1載體提取病毒RNA，按照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書合成cDNA，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增S1基因。同時(shí)以全長(zhǎng)pGEX-6p-1載體為模板，PCR擴(kuò)增獲得線性載體片段。反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，S1-F/6p-1-F(10 μmol/L)、S1-R/6p-1-R(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 15/50 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)TAE瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，純化得到帶有載體同源臂的S1(N-CTD)基因和線性載體備用。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定利用無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行S1基因和載體的同源重組。無(wú)縫克隆程序?yàn)?0℃反應(yīng)15 min。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取單菌落，經(jīng)菌液PCR鑒定為正確的重組菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，并命名為pGEX-6p-1-S1，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 構(gòu)建pGEX-6p-1-S1重組質(zhì)粒的引物信息

1.6 S1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將pGEX-6p-1-S1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取適量菌液，以1∶100的比例接種到含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)搖至菌液D600 nm值至0.4～0.6，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.6～1.0 mmol/L，16℃、150 r/min擴(kuò)搖24 h，以誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。同時(shí)設(shè)立空載體轉(zhuǎn)化至BL21的菌液作陰性對(duì)照。收獲菌液后離心收集沉淀，加適量PBS緩沖液重懸細(xì)菌沉淀，加入蛋白酶抑制劑，吹打混勻，超聲破碎細(xì)胞30 min，10 000×g分別收集上清、沉淀。分別加SDS上樣緩沖液煮沸10 min，隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)分析。將蛋白膠置于考馬斯亮藍(lán)染色液中至條帶清晰，觀察試驗(yàn)結(jié)果后，大量表達(dá)S1重組蛋白，用GST標(biāo)簽瓊脂糖凝膠進(jìn)行蛋白純化，BCA法測(cè)定純化后S1蛋白濃度。

1.7 動(dòng)物免疫及多克隆抗體的制備將純化后的重組S1蛋白(200 μg/只)與弗氏完全佐劑按照等體積比例混合制成試劑，對(duì)6～8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行皮下注射。后續(xù)免疫分別間隔2周進(jìn)行，劑量同初次免疫，使用弗氏不完全佐劑。第3次免疫后7 d進(jìn)行尾部采血收集血清以測(cè)定血清抗體效果。

1.8 多克隆抗體反應(yīng)性測(cè)定

1.8.1Western blot鑒定 SADS-CoV病毒液經(jīng)超速離心濃縮后加SDS上樣緩沖液煮沸變性進(jìn)行蛋白凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，1×TBST清洗3次，以制備的SADS-CoV S1蛋白的多克隆抗體為一抗，室溫孵育2 h，1×TBST清洗3次，以山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析。

1.8.2間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)分析 Vero細(xì)胞提前接種至24孔板，待匯合后每孔以0.1 MOI SADS-CoV感染，感染后24 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛溶液，4℃固定30 min，PBS洗滌3次，加入0.1% Trition100穿膜劑后室溫放置15 min，洗滌，加5% BSA室溫封閉1 h后清洗3次。S1蛋白陽(yáng)性血清用PBS以1∶100比例稀釋后加入24孔板，并用小鼠陰性血清設(shè)立對(duì)照組，4℃孵育2 h后洗滌。用PBS緩沖液以1∶400稀釋FITC-羊抗鼠-IgG，加入到24孔板中，常溫避光孵育1 h，棄二抗后洗滌，加DAPI，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 S1基因的PCR擴(kuò)增S1基因PCR膠回收產(chǎn)物和pGEX-6p-1載體經(jīng)無(wú)縫克隆后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與S1基因的預(yù)期大小相符，約為1 155 bp(圖 1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.S1基因PCR產(chǎn)物

2.2 S1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-S1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，加入終濃度為0.6～1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行 SDS-PAGE 鑒定。結(jié)果顯示，重組S1蛋白(GST-S1)以可溶性形式大量表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為70 kDa，與預(yù)期蛋白大小相符(圖 2)。

利用GST瓊脂糖凝膠純化蛋白，可得到純度較高的S1蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定其質(zhì)量濃度為880 mg/L。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.未誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1 空載體；2.未誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1-S1 重組菌體；3.誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1 空載體蛋白上清；4.誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1 空載體蛋白沉淀；5.誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1-S1 重組菌體裂解蛋白上清；6.誘導(dǎo)的 pGEX-6p-1-S1 重組菌體裂解蛋白沉淀；7.純化后的重組 pGEX-6p-1-S1 蛋白

2.3 Western blot 檢測(cè)以制備的SADS-CoV S1蛋白的多克隆抗體為一抗，山羊抗鼠HRP-IgG為二抗，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，制備的多克隆抗體能有效識(shí)別和結(jié)合SADS-CoV S蛋白，可用于SADS-CoV S蛋白的Western blot檢測(cè)(圖 3)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.SADS-CoV濃縮病毒

2.4 IFA 檢測(cè)以制備的抗SADS-CoV S1蛋白的多克隆抗體作為一抗，以熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，以未感染SADS-CoV病毒的Vero E6細(xì)胞為對(duì)照(Mock)，對(duì)SADS-CoV感染后的細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果表明，制備的鼠抗SADS-CoV S1蛋白多克隆抗體可以用于IFA檢測(cè)SADS-CoV S1蛋白(圖 4)。

圖4 鼠抗pGEX-6p-1-S1蛋白多克隆抗體識(shí)別天然SADS-CoV S1蛋白的 IFA檢測(cè)

3 討論

近年來(lái)，動(dòng)物冠狀病毒對(duì)人類、畜禽健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。冠狀病毒在自然界廣泛存在且宿主多樣，故對(duì)其生物安全防控具有重要意義[6]。SADS-CoV是2017年有報(bào)道在我國(guó)南部新發(fā)現(xiàn)的第6種豬冠狀病毒[8-9]，迄今為止僅呈現(xiàn)區(qū)域性散發(fā)感染。秦俁等[10]對(duì)SADS-CoV的全基因組核苷酸序列和復(fù)制酶(RdRp)、ORF1a/1b、M、N蛋白的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析及S蛋白結(jié)構(gòu)同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)SADS-CoV很可能屬于甲型和乙型冠狀病毒之間的重組。LI等[11]對(duì)2018年在福建省暴發(fā)的SADS-CoV的毒株CH/FJWT/2018進(jìn)行全基因組序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)該毒株可能來(lái)源于當(dāng)?shù)仳穑怯蓮V東傳播。該研究提示SADS-CoV可能不僅只有一種基因型，若不同分離株的S蛋白的基因組序列有較高的差異性，其抗原表位也造成較大不同；這可能導(dǎo)致其抗體無(wú)法抵抗新流行的病毒株。YANG等[12]發(fā)現(xiàn)SADS-CoV在體外可感染人、豬、蝙蝠、雞、鼠及非人靈長(zhǎng)類等20余種動(dòng)物細(xì)胞，呈現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞種屬嗜性。此外，EDWARDS等[13]驗(yàn)證了SADS-CoV能在來(lái)自人類呼吸道和胃腸道等原代細(xì)胞中有效復(fù)制，提示SADS-CoV在人類和動(dòng)物群體中具有潛在的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)，所以預(yù)防和控制SADS-CoV的傳播，具有極為重要的公共衛(wèi)生意義[9，14]。

目前，SADS-CoV的檢測(cè)方法主要有RT-PCR、間接ELISA、IFA、免疫組織化學(xué)(IHC)等[15]，但至今尚未研制出針對(duì)SADS-CoV的特效藥物和有效疫苗。考慮到感染該冠狀病毒的仔豬具有極高的發(fā)病率和病死率，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，因此在疫苗研發(fā)上市之前，SADS-CoV的早期診斷對(duì)其防控有著至關(guān)重要的作用。

鑒于SADS-CoV S1蛋白能夠有效誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答，是疫苗研制的關(guān)鍵蛋白。根據(jù)多克隆抗體血清具有周期較短、操作簡(jiǎn)單、成本較低、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)勢(shì)[16]，同時(shí)利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、抗污染能力強(qiáng)，表達(dá)產(chǎn)量高、分離純化簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)[17]，本試驗(yàn)構(gòu)建出了pGEX-6p-1-S1原核表達(dá)載體，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的條件后，利用GST凝膠純化出了可溶性表達(dá)的S1重組蛋白，其大小為70 kDa。SDS-PAGE和Western blot試驗(yàn)結(jié)果表明S1重組蛋白可與SADS-CoV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，并且具有較高的純度和良好的反應(yīng)原性。利用S1重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備的多克隆抗體血清，Western blot和IFA結(jié)果顯示其反應(yīng)性和特異性良好。綜上，本研究為進(jìn)一步探索SADS-CoV S1蛋白功能及相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。