防治病毒性肺炎中連花清瘟膠囊重要靶點DPP4的生物信息學分析?

宮沛鈺，徐 捷，王一婕

(1.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中 030600；2.山西省中西醫結合醫院，太原 030001；3.山西中醫藥大學實驗管理中心，山西晉中 030600)

2019年新型冠狀病毒感染自武漢爆發后，迅速蔓延至世界各地，包括日本、新加坡、美國、意大利等地，構成了國際關注的突發公共衛生事件[1]。爆發以來，國內外患病及死亡人數呈指數上升，大多數感染者均會出現發熱癥狀，病情嚴重者可并發肺炎、多器官功能衰竭，甚至死亡[2,3]。此次病毒性肺炎嚴重威脅全人類生命健康，但目前為止沒有治療該病毒性肺炎的特效藥物，因此開展相應的防治工作至關重要。

新型冠狀病毒感染發生后，中藥復方制劑——連花清瘟由于其廣譜抗病毒抑菌、調節免疫系統、抗炎、止咳等作用受到研究者廣泛關注[4-6]。經藥理學實驗研究，DPP4(Dipeptidyl peptidase 4)是連花清瘟膠囊的靶點蛋白之一[7,8]。DPP4是一種具有獨特底物特性的氨肽酶，與細胞膜結合后具有較強的催化活性，能夠裂解第2位為丙氨酸或脯氨酸的蛋白質[3]使體內GLP-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)水平的降低，引起血糖升高，因此，早期研究中DPP4常用于2型糖尿病的治療[9]。臨床發現患有有糖尿病、高血壓、其他呼吸道和心血管疾病等基礎疾病的患者，一旦感染更容易發展為重癥患者[3,10]。其中2型糖尿病患者感染病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)后轉為重癥患者的比率為普通患者的3倍，且多預后較差，這與慢性高血糖帶來的慢性炎癥密切相關[11]。隨著對病毒性肺炎的深入研究，研究者發現患者的病情與DPP4的血糖及調節代謝作用密切相關[12]。因此通過調節DPP4功能可有效緩解病毒性肺炎病情。

此外，研究發現DPP4與呼吸系統疾病有密切聯系[13-17]，臨床中使用格列汀類等DPP4抑制劑后，患者炎癥得到緩解，病毒性肺炎的癥狀進展情況得以控制[18-19]。不斷有證據顯示DPP4與SARS-CoV-2的宿主受體蛋白ACE2之間在發病機制中存在相關性[20]。在2020年的一項研究中，研究人員對SARS-CoV-2棘突蛋白同源三聚體結構進行了建模，該模型證明SARS-CoV-2的S1糖蛋白與DPP4之間存在一個結合面，表明兩者之間存在緊密的相互作用[21]。另有學者認為，SARS-CoV-2的刺突蛋白與人DPP4的相互作用可能是影響病毒侵入力和毒力的重要因素[22]。

連花清瘟膠囊作為病毒性肺炎醫學觀察期的重點推薦藥物，對DPP4等靶點蛋白產生了綜合靶向效果。然而，研究認為不同物種、不同變異體的DPP4蛋白構象差異可能造成病毒侵入或藥物治療時產生不同的效果[23]。因此，對DPP4基因、蛋白的結構與功能進行深入研究就顯得尤為必要。本研究擬通過生物信息學手段針對DPP4基因與蛋白進行了系統的整理與分析，為DPP4在SARS-CoV-2等病毒侵入宿主細胞和連花清瘟膠囊等藥物防治等方面的研究打下基礎，以期為相關領域的深入開發提供可靠的思路。

1 材料與方法

1.1 基因及蛋白序列

DPP4基因及蛋白數據來自美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)蛋白數據庫，基因登錄號為：BAG70153.1。

1.2 分析方法

1.2.1 DPP4理化性質分析 使用ExPASy系統中的ProtParam軟件分析DPP4的分子式、分子量、酸堿性、等電點和穩定性等理化性質；通過Protscale對DPP4蛋白的親疏水性做進一步驗證；在SignalP 4.0 Server中分析DPP4信號肽結構；TMHMM Server v.2.0軟件預測DPP4的跨膜區域。

1.2.2 DPP4空間結構預測 使用PSORTⅡ軟件研究DPP4蛋白在亞細胞水平的定位情況，通過SOPMA軟件分析DPP4蛋白的二級結構，由SWISS-MODEL建模得到DPP4蛋白的三級結構。

1.2.3 DPP4蛋白修飾位點預測 使用NetPhos3.1軟件預測DPP4蛋白的磷酸化位點；其中N-糖基化位點由NetNGlyc 1.0 Sever進行預測；O-糖基化位點由NetOGlyc 4.0 Server和YinOYang 1.2 Server兩個軟件共同預測。

1.2.4 DPP4蛋白功能預測 使用STRING軟件對DPP4的相關蛋白相互作用關系進行預測并對DPP4參與的各種生物活動進行綜合分析。在MEGA X軟件中對DPP4蛋白通過算法進行系統進化樹的構建。

2 結果

2.1 DPP4蛋白的基本性質研究結果

DPP4蛋白的分子式為C4007H6017N1025O1179S27，分子量為88278.63，共由20種、766個氨基酸組成，其中絲氨酸(S)共64個，占比最高，為8.4%，半胱氨酸(C)共12個，占比最低，為1.6%(見圖1)。

圖1 DPP4蛋白的氨基酸組成情況

根據ProtParam軟件的分析，DPP4蛋白帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)為86，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)為70，理論等電點為5.67，屬于酸性蛋白。ProtParam軟件在280 nm處在水中測量蛋白質的消光系數，并以M-1cm-1為單位。當假設所有Cys殘基對均形成胱氨酸時，吸光度0.1%(=1 g/L)為2.262，消光系數為199 690；當假設所有Cys殘基都消除時，吸光度0.1%(=1 g/L)為2.254，消光系數為198 940。DPP4蛋白氨基酸序列的N端氨基酸為甲硫氨酸(M)，在體外的哺乳動物網織紅細胞中的半衰期為30小時。此外，ProtParam軟件對DPP4蛋白的不穩定指數(II)計算為43.35，歸類為不穩定蛋白，脂肪指數為80.29，親水性總平均值(GRAVY)為-0.340，為親水性蛋白。

接著通過Protscale對DPP4蛋白的親疏水性做出進一步驗證，據Protscale軟件分析，DPP4蛋白親疏水性正值得分最高位點位于第24位，為脯氨酸(P)殘基，得分為2.989，此處疏水性較強；負值得分最高點位于第681位，為天冬氨酸(D)殘基，得分是-2.522，此處親水性較強(見圖2)。從圖中可以看到，DPP4蛋白的氨基酸殘基的得分大多為負值，綜合考慮Protscale軟件和ProtParam軟件的分析結果，可以判定DPP4蛋白應為親水性蛋白。

圖2 DPP4蛋白的親疏水性分析

通過預測信號肽結構有助于分析蛋白質的分布及功能，在SignalP 4.0 Server中將生物群選為真核生物后對DPP4信號肽結構的預測。分析其結果，其中C值為切割位點分數，在切割位點處數值較高，S值得分高低可以表示氨基酸是否為信號肽的一部分，Y值是綜合C值與S值的結果，其值能夠更好地判斷切割位點(見圖3)。

圖3 DPP4的信號肽預測結果

通過SignalP 4.0 Server對數據的最終分析結果，結果顯示沒有證據可以表明DPP4蛋白在N端存在信號肽結構，如表1。

表1 DPP4的信號肽預測數據

由于缺少信號肽的導向，進一步分析了DPP4的轉運和分泌方式。通過SecretomeP 2.0 server進行分析，DPP4蛋白的NN評分0.719，而該軟件建議哺乳動物蛋白氨基酸序列的閾值應為0.6，因此有理由認為DPP4蛋白是一種非經典分泌蛋白。

隨后，對DPP4蛋白的跨膜結構進行預測分析，在TMHMM Server v.2.0中提交DPP4的氨基酸序列可知，1位到6位位于膜內，共6個氨基酸殘基，7位到29位為跨膜螺旋結構，共23個氨基酸殘基，30位到766位位于膜外，共737個氨基酸殘基(見圖4)。因此，DPP4蛋白共擁有1個跨膜結構域。

圖4 DPP4的跨膜結構預測結果

2.2 DPP4基因及蛋白的表達及定位研究結果

對基因及蛋白表達或定位的研究有利于分析疾病發生發展或病原體的侵入行為。因此從NCBI-Gene數據庫中得到DPP4基因的轉錄組測序結果，該結果是對代表27種不同組織的95名人類個體的組織樣本進行的RNA-seq分析，該分析方法可以反應多種或某種RNA的表達水平，分析結果可以確定蛋白質編碼基因的組織特異性，結果以RPKM(reads per kilobase per million reads placed)表示。分析可知，DPP4在小腸中的表達量最高，其RPKM為69.428±12.497，其次為胎盤(56.296±12.816)、前列腺(55.334±32.766)、十二指腸(52.87±1.368)、腎(48.435±22.184)等，均有較高的表達。DPP4在胰腺中的表達量最低，其RPKM僅為0.369±0.089，另外在骨髓(0.428±0.11)、腦(0.488±0.079)、心(0.807±0.415)、睪丸(0.871±0.276)等組織中的表達也較低(見圖5)。

圖5 DPP4轉錄組測序結果

同時，進一步研究DPP4蛋白在亞細胞水平的定位情況，以期為靶向藥物的研究提供更詳盡的理論參考。PSORTⅡ軟件的預測結果認為，DPP4蛋白在內質網中分布最多，占比55.60%，而在線粒體、細胞質、細胞核、高爾基體等亞細胞結構中分布較少，均為11.10%。此外，通過提交的DPP4蛋白的氨基酸序列，PSORTⅡ軟件子程序還提供了更多的DPP4蛋白預測信息：根據該軟件的PSG信號肽預測結果，支持SignalP 4.0 Server軟件所作出的DPP4不含N端信號肽的預測結果；MTOP膜拓撲結構預測結果顯示，DPP4蛋白的N端位于細胞膜內，其拓撲結構為2型。

2.3 DPP4蛋白的多級結構預測結果

確定蛋白質的多級結構是新藥研發及蛋白生理活性研究的重要基礎，在此，確定DPP4蛋白的二級結構、保守結構域及三級結構。通過SOPMA軟件分析DPP4蛋白的二級結構(見圖6)。圖中藍色線條或字母代表α螺旋，共139個氨基酸殘基占比18.15%；紅色線條或字母代表延伸鏈，共227個氨基酸殘基占比29.63%；綠色線條或字母代表β轉角，共50個氨基酸殘基占比6.53%；紫色線條或黃色字母代表無規卷曲，共350個氨基酸殘基占比45.69%。

圖6 DPP4的二級結構預測結果

通過NCBI的Blast功能對DPP4蛋白進行序列比對，以分析其所包含的結構域。分析結果顯示，DPP4蛋白共包含4個保守結構域，分屬四個不同的超家族，它們分別為DPPIV_N結構域、Peptidase_S9結構域、DAP2結構域和DPPIV_rep結構域(見圖7)。這些保守結構域的分布幾乎占滿了DPP4蛋白的整個氨基酸鏈，推測DPP4蛋白的整體結構是相對保守的。關于這些結構域的分布位置和具體描述(如表2)。因此，DPP4作為一種氨肽酶，其主要的生理活性主要依賴位于第398-763位的酶活性結構域。

圖7 DPP4蛋白保守結構域的預測結果

表2 DPP4蛋白保守結構域的描述

DPP4蛋白的三級結構由SWISS-MODEL建模，該軟件通過50個模板進行分析，共得到1個匹配的蛋白質三級結構(圖8)。該模型的預測范圍為第39-766位氨基酸，覆蓋率為1.00，其GMQE(全球模型質量估計)為0.90，QMEAN(定性模型能量分析)為0.91±0.05，表明模型可靠性較高。此外，經分析，該蛋白為同源二聚體。圖8a為DPP4蛋白的空間結構模型，圖中從藍色到紅色表示的是肽鏈從N端到C端的折疊結果。從圖中可以看到，該蛋白的空間結構程中間細兩端粗的啞鈴形，而兩端均為藍色的N端氨基酸殘基，中間最細處則為紅色的C端氨基酸殘基。圖8b為DPP4蛋白模型，圖中可以清楚地反映出蛋白質的各種二級結構及其位置，經分析，該模型與SOPMA軟件所分析的二級結構較為吻合，二者互為印證。圖8c為DPP4蛋白三級結構預測結果的拉氏圖，每一個圓點代表一個氨基酸殘基，這些不同顏色的圓點與圖9b中的氨基酸殘基一一對應，它們所處的區域代表了三級結構與這些氨基酸殘基的匹配程度，其中綠色區域代表匹配程度偏好，淺綠色區域代表匹配程度較好，淺灰色區域代表匹配程度尚可。從圖中可以看到，大部分氨基酸殘基都落在綠色和淺綠色區域，因此有理由認為該三級結構的可信度較高。圖8d表示DPP4蛋白結構預測結果與各個位點之間的相似度分析結果，圖8e表示預測結果與非冗余PDB結構集的比較，圖中紅色星號表示預測結果所處位置。d、e兩圖都為三級結構預測結果可靠性的佐證。

(a)DPP4蛋白的空間結構模型；(b)DPP4蛋白的卡通模型；(c)DPP4蛋白的三級結構預測結果拉氏圖；(d)預測結果與各位點氨基酸相似度分析結果；(e)預測結果與非冗余PDB結構集的比較。

2.4 DPP4蛋白翻譯后修飾位點的預測結果

翻譯后修飾位點的確定有利于分析蛋白質在不同生理或生化過程中的作用及變化規律，包括蛋白糖基化位點和蛋白磷酸化位點。蛋白糖基化位點分為N-糖基化位點和O-糖基化位點，其中N-糖基化位點由NetNGlyc 1.0 Sever進行分析(圖9)。DPP4共有9個N-糖基化位點，分別為85位N(0.6878)、92位N(0.6603)、150位N(0.6526)、219位N(0.5259)、229位N(0.5908)、263位N(0.8064)、281位N(0.6590)、321位N(0.6873)、520位N(0.6908)，根據軟件的評審意見，第85、92、263、321位應被認定為最有可能的蛋白N-糖基化位點，但是第263位天冬酰胺殘基之后出現了脯氨酸，這樣的構象限制使得天冬酰胺不太可能被糖基化，因此該位點也應被排除。O-糖基化位點由NetOGlyc 4.0 Server和YinOYang 1.2 Server兩個軟件共同預測，其中，NetOGlyc 4.0 Server預測到7個得分超過0.5的位點，分別為32位T(0.580817)、39位S(0.618924)、42位T(0.797068)、44位T(0.802528)、251位T(0.500000)、284位S(0.648953)、350位T(0.640132)；YinOYang 1.2 Server預測到7個超過閾值線的位點，分別為156位T(0.5346)、251位T(0.4928)、273位T(0.5138)、280位T(0.6942)、333位S(0.4368)、637位S(0.5580)、657位S(0.6129)(圖10)。兩個軟件共預測出13個可能的蛋白O-糖基化位點，其中251位T被兩個軟件同時命中。絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)均有可能成為蛋白質的磷酸化位點，這一結果由Netphos 3.1 Server軟件進行預測(圖11)。由于所命中的高于閾值線(0.5)的位點過多，因此選取19個得分高于0.9的位點記錄如下：39位S(0.957)、64位S(0.944)、101位S(0.983)、127位S(0.996)、166位Y(0.915)、173位Y(0.983)、188位T(0.935)、278位S(0.985)、312位S(0.992)、323位S(0.972)、334位S(0.981)、376位S(0.983)、381位Y(0.952)、462位S(0.957)、537位S(0.961)、583位S(0.994)、614位S(0.912)、662位Y(0.946)、686位S(0.925)，這些位點的得分較高，因此它們成為蛋白磷酸化位點的置信度也較高。

圖9 DPP4的N-糖基化位點預測結果

圖10 DPP4的O-糖基化位點預測結果

圖11 DPP4的磷酸化位點預測結果

2.5 DPP4相關蛋白的相互作用預測結果

分析蛋白質在生理或生化過程中的功能及調控機制，需要對其與相關蛋白的相互作用進行了解。在設置最高置信度(0.9)且相關蛋白不超過10個后，STRING軟件對DPP4的相關蛋白相互作用關系網絡預測。分析得到與DPP4產生相互作用的6個蛋白質，分別為ACE2(血管緊張素轉換酶2，得分0.942)、ADA(腺苷脫氨酶，得分0.918)、GCG(胰高血糖素，得分0.994)、GIP(胃抑制多肽，得分0.993)、INS(胰島素，得分0.942)、MME(腦啡肽酶，得分0.928)(圖12)。

圖12 DPP4相關蛋白的相互作用

同時，STRING軟件對DPP4參與的各種生物活動進行了綜合分析。基因本體(GO)數據庫的分析中，DPP4蛋白參與的生物過程較多，選取具有代表性的10項生物過程(表3)。從表中可知該蛋白主要參與血管緊張素的調節、糖代謝、炎性反應、介導病毒侵襲宿主等。DPP4參與的GO分子功能共有9項，主要涉及病毒受體活性、激素活性、鈉離子結合以及各種酶活性等功能(表4)。KEGG通路分析中，DPP4共參與3條代謝通路，分別為腎素-血管緊張素系統、胰島素分泌、蛋白質消化吸收(表5)。

表3 DPP4參與的GO生物過程

表4 DPP4參與的分子功能

表5 DPP4參與的信號通路

2.6 DPP4蛋白系統進化樹的構建

在研究SARS-CoV-2侵入宿主細胞的過程和機理時，應采用DPP4蛋白親緣性與人類最高的物種，而通過構建系統進化樹就可以直觀地反映出不同物種之間同類蛋白的親緣關系。在NCBI-Protein數據庫中下載得到人、小家鼠、黑猩猩、牛、北美鼠兔等15個物種的DPP4蛋白氨基酸序列，在MEGA X軟件中首先通過Clustal W進行序列比對，再以Neighbor-Joining算法進行系統進化樹的構建(圖13)。分析結果表明，人類的DPP4蛋白與靈長類動物如黑猩猩、東非狒狒等的親緣關系最近，其次與北美鼠兔、普氏野馬、牛等物種的親緣關系較近，而與嚙齒類動物如小家鼠、褐家鼠等的親緣關系較遠。因此在研究SARS-CoV-2侵入宿主細胞中DPP4蛋白的作用時，不應使用小鼠作為模型動物，而應選擇與人屬關系更近的動物進行實驗研究。

圖13 DPP4在不同物種間的系統進化樹

3 討論

DPP4作為防治病毒性肺炎中連花清瘟膠囊在體內的重要靶點，無論是在病毒侵入宿主細胞的機理，還是在連花清瘟膠囊防治功效的研究中，都是一個備受關注的重要環節。本研究通過生物信息學手段，深入細致預測并分析了DPP4基因及蛋白的相關信息。預測結果顯示，DPP4是一個親水性非經典分泌蛋白，具有一個跨膜結構，并在小腸中表達較為豐富，亞細胞分布研究表明其主要分布在內質網。DPP4蛋白的翻譯后修飾位點較多，預測到第85、92、321位的三個置信度較高的蛋白N-糖基化位點，13個可能的蛋白O-糖基化位點，以及19個置信度很高的蛋白磷酸化位點。豐富的修飾位點不僅提示蛋白質具有復雜的生理功能，也為研究者開發相對專一的靶向藥物提供了更多的角度。

對DPP4蛋白保守結構域的預測結果中發現：DPP4蛋白具有酶活性的保守結構域位于C端一側，而N端的保守結構域具有非酶的其他活性功能，因此在研發針對DPP4蛋白的抑制劑時，應著眼于破壞其C端結構。有趣的是，通過預測并分析DPP4蛋白的三級結構后，發現其空間構象為啞鈴形，而且啞鈴的兩端是N端氨基酸殘基折疊成的膨大結構，中間則是C端氨基酸殘基折疊成的纖細結構，這樣的奇特構象雖然可以通過兩端的結構將中間的酶活性部位保護起來，但是如果設計一種卡子化合物，通過空間構象的靶向性與DPP4蛋白產生特異性結合，并切斷中間的酶活性單元，即可高效且專一地抑制DPP4蛋白的活性。蛋白相互作用預測顯示，DPP4與ACE2具有較高置信度的相互作用關系。當前研究認為，SARS-CoV-2侵襲宿主細胞主要依賴于刺突蛋白(S蛋白)與宿主細胞ACE2的結合，因此ACE2是人們研究防治病毒性肺炎方法的一個重要突破點。GO分析顯示，DPP4參與了病毒侵入宿主細胞的生物過程，而且具有表達病毒受體活性的分子功能，因此DPP4也將是SARS-CoV-2結合ACE2并侵入宿主的關鍵環節。已有研究猜測，ACE2-TMPRSS2-Furin-DPP4軸可能正是SARS-CoV-2侵襲宿主細胞的轉導路徑[24]，本文研究為這樣的猜測提供了有力的佐證。此外，GO和KEGG分析還指出了DPP4在調節糖代謝和介導炎性反應中的重要作用。如前文所述，研究者們為患者加用DPP4抑制劑后均取得了較為滿意的效果，成功阻止了患者肺部持續的細胞因子風暴，降低了2型糖尿病患者由于慢性高糖帶來的炎性反應，可謂一舉多得。由于連花清瘟膠囊對DPP4同樣具有明確的靶向作用，因此該藥對病毒性肺炎的防治效果是可靠且具有明確依據的。

目前，隨著傳染性更強、毒力更大的變異毒株的出現，開發特效的治療藥物將是研究者們很長一段時間內的奮斗目標。本文通過對DPP4進行深入且系統地分析，更加全面地闡述了連花清瘟膠囊在防治病毒性肺炎的其中一條通路的原理，為中藥現代化研究提供了可靠的研究角度，對相關抑制劑的研發具有參考意義。