人參對自發性糖尿病小鼠的腎臟保護作用及機制研究?

劉媛媛，劉軼凡，胡 潔，肖 遙，田楚簫，周 楠，傅 強△

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院腎病科，北京 100029)

糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病重要的微血管并發癥，我國約有20%～40%的糖尿病患者合并DKD，現已成為慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因[1-2]。早期腎臟病變具有可逆性,進入顯性蛋白尿期后則發展迅速且不可逆，因此DKD的早期防治尤為重要?，F代醫學尚無治療DKD的有效藥物，主要通過管理血糖、血壓延緩其發展，中醫藥具有療效好、副作用小等優點，為DKD的早期防治提供了可能[3]。

人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，經曬干者稱生曬參，經蒸熟并干燥者稱紅參，有大補元氣、生津止渴之效，是臨床治療糖尿病及其并發癥的有效藥物。研究發現，人參的有效成分具有抗衰老、抗疲勞、調節免疫力等藥理作用[4]。炎癥與氧化應激被認為是DKD發生發展的重要病理機制，并可進一步激活其他DKD進展相關的機制通路[5-7]，故本研究以此為切入點，觀察了人參對自發性糖尿病小鼠糖脂代謝、腎功能、腎臟病理等的影響，旨在探討其對腎臟保護作用及內在機制，以指導臨床治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡雄性自發性2型糖尿病db/db(C57BLKS)小鼠18只，體質量35～40 g；同周齡雄性同窩野生型db/m小鼠6只，體質量20～25 g，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(蘇2016-0010)]。飼養于北京中醫藥大學東直門醫院SPF級環境屏障動物實驗室[SYXK(京)2020-0013]，飼養環境溫度為20～26 ℃，日溫差≤3℃，相對濕度40%～70%，12 h光/暗周期。常規喂養飼料及飲用水，基礎飼料配方：糖水化合物65%、蛋白質24.2%、脂肪10.3%，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(貨號1022)。動物實驗方案經北京中醫藥大學動物福利委員會批準(編號為21-19)，實驗期間按照3R原則給予實驗動物人道關懷。

1.2 藥物

生曬參飲片(產地：吉林)由東直門醫院草藥房自同仁堂采購并鑒定，依據臨床常規煎煮方法，取生曬參3 g(劑量依據預實驗確定)置于砂鍋中，加蒸餾水500 mL，浸泡30 min，武火煮沸，改文火煎煮45 min，用雙層棉紗布過濾；再加入蒸餾水300 mL，武火煮沸，改文火煎煮30 min，過濾后將兩次濾液合并濃縮至含生藥39 mg/mL，分裝后4 ℃保存，每周按上述方法煎煮一次備用。鹽酸二甲雙胍片(0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023370)，稱取1.5 g鹽酸二甲雙胍片并粉碎，用蒸餾水配成濃度為19.5 mg/mL的鹽酸二甲雙胍混懸液，4 ℃儲存備用，用時室溫放置60 min,振搖使其混勻，每周配置一次。

1.3 試劑及儀器

總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測定試劑盒、肌酐(creatinine，Cr)測定試劑盒、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測定試劑盒、糖化血清白蛋白(glycated serum protein，GSP)測定試劑盒，蘇木素-伊紅染色液、馬松染液、愛先藍-糖原染液均購自南京建成生物工程研究所(貨號分別為A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、C011-2-1、C013-2-1、A037-2-1、D006、D026-1-2、D033-1-1)；尿微量白蛋白試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(貨號：ML063626-2)；丙二醛(glycated serum protein，MDA)比色法測試盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)比色法測試盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)比色法測試盒、白介素1β(interleukin1β，IL-1β)ELISA 試劑盒、白介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)ELISA試劑盒均購自武漢Elabscience公司(貨號分別為E-BC-K025-M、E-BC-K020-M、E-BC-K031-M、E-MSEL-M0003、E-MSEL-M0001、E-MSEL-M0002)；bx51型光學顯微鏡，日本Olympus公司；MK3型酶標儀，德國賽默飛世爾儀器有限公司；D1008E型渦旋機，美國SCILOGEX公司；ICV-450型電熱恒溫培養箱，日本ASONE公司；H1650-W型臺式微量高速離心機，湖南湘儀離心機有限公司；RM2135型石蠟切片機，德國Leica公司；EG1140H型包埋機，德國Leica公司。

1.4 分組及給藥

18只db/db小鼠隨機分為模型組、人參組、二甲雙胍組，以6只db/m小鼠為正常組。人參組給予0.39 g/kg生曬參水煎劑灌胃、二甲雙胍組給予0.195 g/kg藥物混懸液灌胃、模型組、正常組給予等體積蒸餾水灌胃(10 mL/kg)，每日1次，連續灌胃9周。小鼠劑量(g/kg)=9.1×人的臨床劑量(g/kg)[8]。

1.5 觀察指標與標本收集

觀察小鼠的精神狀態、活動情況、毛發、飲食、飲水、排便、排尿等情況，每周測量小鼠體質量。取材前使用代謝籠收集各組小鼠6 h尿液，4 ℃ 3000 r/min，離心15 min，計算尿量，取上清液按照試劑盒說明書步驟檢測并計算得出尿微量白蛋白與尿肌酐比值(albumin/urine creatinine ratio，ACR)及6 h尿微量白蛋白(six hours urinary total protein，6 h UTP)。灌胃9周后將小鼠處死，處死前禁食水12 h，3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后進行摘眼球取血，1200 g離心20 min，收集上清液分裝保存于-80 ℃冰箱。摘取腎臟，一半置于4%多聚甲醛中固定，另一半置于凍存管中，-80 ℃冰箱保存。

1.6 腎臟病理學檢查

將固定后的腎組織取出，石蠟包埋、切片、進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、糖原(periodic acid-schiff stain，PAS)染色和馬松(Masson)染色，封片后光學顯微鏡下觀察小鼠腎臟病理改變。

1.7 血清指標測定

糖脂代謝指標：甘油磷酸氧化酶法檢測小鼠血清TG、TC，雙試劑直接法檢測LDL-C，果糖胺法測定GSP的表達水平。腎功能指標：肌氨酸氧化酶法檢測小鼠血清Cr，脲酶法檢測小鼠血清BUN表達水平。氧化應激指標：比色法測定CAT、MDA、SOD的表達水平；炎癥指標：酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況及體重比較

正常組小鼠毛色光亮，行動敏捷，體型瘦長，活動頻繁。模型組、人參組、二甲雙胍組小鼠形體肥胖，動作遲緩，活動少，攝食及飲水增多，灌胃后期模型組小鼠出現豎毛，體溫偏低，對外界刺激反應遲鈍的現象。db/db小鼠灌胃前體質量約40 g，db/m小鼠體質量約25 g。與模型組比較，人參組體質量增長趨勢減緩，自第6周起差異有統計學意義(第6、7周P<0.05，第8、9周P<0.01)。人參組與二甲雙胍組無差異無統計學意義。見圖1。

注：人參組與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 尿蛋白指標變化

如表1所示，與正常組比較，模型組尿蛋白顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，人參組ACR、6 h UTP顯著下降(P<0.01)。二甲雙胍組6hUTP顯著下降(P<0.01)，ACR有下降趨勢，但差異無統計學意義。人參組與二甲雙胍組比較，差異無統計學意義。

表1 各組小鼠尿蛋白水平比較

2.3 腎臟組織病理形態變化

小鼠腎臟HE染色結果顯示：正常組腎臟組織結構大體正常，腎小球未見明顯增大，系膜細胞、系膜基質、腎小囊未見明顯異常，腎間質未見明顯異常及纖維化。模型組與正常組比較，腎小球肥大明顯，毛細血管袢擴張充血嚴重，系膜細胞增殖，系膜基質擴張，腎小囊變窄，腎間質嚴重充血水腫，纖維組織增生，可見大片嚴重的炎細胞浸潤。與模型組比較，人參組及二甲雙胍腎小球肥大較輕，毛細血管袢擴張充血，系膜細胞增殖，系膜基質擴張，腎小囊變窄較小，見圖2。

小鼠腎臟PAS染色結果顯示，正常組毛細血管袢擴張，系膜基質正常。模型組系膜細胞增殖，系膜基質擴張，腎小囊變窄。與模型組相比，人參組和二甲雙胍組系膜細胞增殖，系膜基質擴張較輕，見圖2。

注：蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)、糖原染色(periodic acid-schiff stain，PAS)；HE：A1正常組、B1模型組、C1人參組、D1二甲雙胍組；PAS：A2正常組、B2模型組、C2人參組、D2二甲雙胍組

小鼠腎臟Masson染色結果顯示：正常組纖維化增生不明顯，模型組纖維化增生明顯。與模型組相比，人參組和二甲雙胍組纖維化程度較輕，見圖3。

注：馬松染色(Masson)A3正常組、B3模型組、C3人參組、D3二甲雙胍組

2.4 糖脂代謝指標變化

如表2所示，與正常組比較，模型組TG、TC、GSP均有顯著升高(P<0.05)，LDL-C有升高趨勢，但差異無統計學意義。與模型組比較，人參組TC、TG顯著下降(P<0.01)，GSP明顯降低(P<0.05)，LDL-C有下降趨勢，但差異無統計學意義。二甲雙胍組TG顯著下降(P<0.01)，TC、GSP、LDL-C均明顯下降(P<0.05)，人參組與二甲雙胍組差異無統計學意義。

表2 各組小鼠血脂及血清白蛋白水平比較

2.5 腎功能指標變化

如表3所示，與正常組比較，模型組BUN顯著升高(P<0.05)，SCr升高，但差異無統計學意義。與模型組比較，人參組和二甲雙胍組BUN、SCr均明顯下降(P<0.01)，但兩組間差異無統計學意義。

表3 各組小鼠腎功能水平比較

2.6 氧化應激指標變化

如表4所示，與正常組比較，模型組SOD、MDA均顯著升高(P<0.05)，CAT顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，人參組SOD、MDA顯著下降(P<0.01)，CAT顯著升高(P<0.05)；二甲雙胍組SOD、MDA顯著下降(P<0.01)，CAT顯著升高(P<0.01)，人參組與二甲雙胍組差異無統計學意義。

表4 各組小鼠血清氧化應激水平比較

2.7 炎癥指標變化

如表5所示，與正常組比較，模型組血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，人參組IL-6、IL-1β、TNF-α均顯著下降(P<0.01)，二甲雙胍組IL-6、IL-1β顯著下降(P<0.01)，TNF-α下降明顯(P<0.05)，人參組與二甲雙胍組差異無統計學意義。

表5 各組小鼠藥物血清炎癥指標水平比較

3 討論

國醫大師呂仁和教授認為，DKD是由于消渴病(糖尿病)內熱傷陰耗氣，日久損及腎絡，痰濕瘀諸邪邪膠結形成“微型癥瘕”，致腎體受損，腎用失司[9]。氣虛是貫穿以上病理過程的關鍵病機，故益氣法是貫穿治療始終的關鍵治法。人參作為治療消渴病益氣藥物的代表，可補五臟之氣，生津液、安精神?！睹t別錄》還記載人參有“止消渴，通血脈，破堅積”的作用。本團隊早期臨床研究發現，以人參、黃連為主要成分的“三黃安消膠囊”具有明顯的降血糖、降血脂、降血壓的效果[10]。前期依托國家自然科學基金課題研究發現，人參、黃連藥對可以起到調節腸道菌群、改善胰島素抵抗的作用[11]。可見，人參在2型糖尿病及其并發癥的防治中的關鍵藥物，但人參單味藥防治DKD的研究相對不足。本研究對人參對糖尿病動物模型的藥效學進行評價，并從氧化應激及炎癥反應角度探究在人參保護腎臟的內在機制。

實驗選用db/db小鼠，具有極度肥胖、多食、多飲、多尿等糖尿病典型臨床癥狀，是研究2型糖尿病及其并發癥的理想模型。其存在顯著的糖脂代謝紊亂，約在16周齡左右可見明顯的蛋白尿及腎小球濾過率的輕度下降，與人類的腎臟疾病病理改變相似，可出現腎小球肥大、系膜基質擴張等多種病理變化[12]。本研究中，模型組18周齡的db/db小鼠出現了顯著糖脂代謝異常，GSP、TC、TG、LDL-C顯著升高，并出現了顯著的蛋白尿和血肌酐的輕度升高，其腎臟病理改變符合，與文獻報道基本一致。研究首先從糖脂代謝、尿蛋白、腎功能等方面對人參藥效學進行了評價。其中由于db/db小鼠隨機血糖波動較大，故選用GSP以反映機體2～3周的血糖代謝情況，有較強的敏感性和穩定性[13]。經人參干預后，反應糖脂代謝的GSP、TG、TC、LDL-C均顯著改善，效果與二甲雙胍相近，反映人參具有良好的調節糖脂代謝的作用。在尿蛋白方面，人參干預后顯著下降了ACR、6hUTP，提示人參對腎小球濾過膜損傷具有一定保護作用。在腎功能方面，db/db小鼠SCr具有上升趨勢，但尚無顯著差異，可能與腎臟損傷尚不嚴重，仍具有一定的代償功能有關。但經人參干預后，BUN、SCr顯著下降，病理染色所見腎臟病理改變較模型組明顯減輕，纖維化減少，說明人參具有保護腎功能的作用，這也印證了氣虛對消渴病進展的影響。

機體的SOD活性、MDA和CAT含量是表征氧化應激水平的常用指標。研究表明，在2型糖尿病的動物模型中，常出現SOD、CAT下降，MDA升高等氧化應激表現。由于胰島B細胞SOD、CAT水平下降且活性較低，ROS可以直接損傷胰島B細胞，ROS還可以作為細胞內信使，通過多種途徑誘導內皮細胞和足細胞損傷及凋亡，誘發腎臟炎癥，引起腎損傷、蛋白尿產生[14]。炎癥因子在DKD中起著重要的作用，常見的炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-α等，在疾病中往往都呈現升高趨勢，大量炎癥因子聚集在腎臟中，一方面可以激活NF-κB通路，加重炎癥反應，另一方面導致ROS增加，進一步加重氧化應激反應[15-17]。本研究從氧化應激與炎癥角度初步探究人參的起效機制，可觀察到人參提升了抗氧化防御體系中關鍵酶SOD、CAT的水平，下降了反映氧化損傷程度的MDA，起到良好的抗氧化能力。除此之外，通過人參干預后，db/db小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α均下降，說明其具有抗炎癥反應的重要作用。部分研究表明，人參的活性成分如人參皂苷Rg1、人參皂苷CK能夠改善血清氧化應激指標、下調炎癥因子，增強腎組織抗氧化能力，增強機體抗疲勞能力，與本研究結果具有一致性[18-20]。

本研究采用二甲雙胍作為陽性藥物對照，二甲雙胍為2型糖尿病一線用藥，研究證實其具有抗炎、抗氧化應激、保護腎功能的作用[21-23]。中藥人參在藥效學方面，與二甲雙胍改善炎癥、氧化應激方面的作用大致相似，但研究中采用劑量為前期實驗確定的動物最佳劑量，相當于臨床劑量的3 g，相信通過適當配伍和調節劑量，其療效能進一步提升。誠然，本研究在藥效學外，僅對其作用機制進行了初步探討，這有待于后續深入研究。

綜上所述，人參可以通過改善炎癥與氧化應激，調節糖脂代謝，發揮對自發性糖尿病小鼠的腎臟保護作用，本研究為臨床應用人參防治DKD提供了一定科學依據。